结合有丝分裂细胞同步化与高分辨率共聚焦显微镜技术研究多功能细胞周期蛋白在有丝分裂过程中的作用

摘要

我们介绍一种用于HeLa细胞的双胸苷同步化方案，随后利用高分辨率共聚焦显微镜进行分析。该方法对于获得大量同步从S期进入有丝分裂期的细胞至关重要，从而能够研究兼具间期功能的多功能蛋白在有丝分裂中的作用。

摘要

以时相依赖的方式研究细胞周期中的各种调控事件，有助于深入理解细胞的生长与分裂过程。将细胞群体同步于细胞周期的特定阶段，已被证明在相关实验研究中具有重要价值。使用毒性相对较低的化学试剂对细胞进行同步化处理，相较于使用药理学抑制剂，更有利于后续细胞周期事件的研究，并可实现对特定有丝分裂阶段的富集。本文介绍了一种用于将人类细胞同步于细胞周期不同阶段的实验方案，包括通过双胸苷阻断与释放程序将细胞同步于S期和M期，以研究有丝分裂蛋白在染色体排列与分离过程中的功能。该方案对于研究兼具明确间期功能的多功能蛋白的有丝分裂作用尤为有效。以我们的研究为例，Cdt1是一种在G1期DNA复制起点许可中起关键作用的蛋白，其有丝分裂功能只有在特异性耗尽G2/M期的Cdt1时才能有效研究。本文详细描述了利用双胸苷同步化方法耗尽G2/M期特异性Cdt1的实验流程。同时，我们还阐述了胸苷释放后的细胞固定方法，以及利用高分辨率共聚焦显微镜进行活细胞成像的技术。该方法同样适用于在生理状态及扰动条件下（例如对Ndc80复合物组分Hec1的研究）分析有丝分裂蛋白的功能，因为它能够提供大量处于有丝分裂阶段的细胞样本，用于固定细胞和活细胞分析，正如本文所示。

引言

在细胞周期中，细胞经历一系列高度调控且时间精确的事件，以实现基因组的准确复制和细胞增殖。在哺乳动物中，细胞周期包括间期和M期。间期分为三个阶段：G1期、S期和G2期，细胞在此期间复制其基因组并进行生长，这是正常细胞周期进程所必需的^1,4。在M期，包括有丝分裂（前期、前中期、中期、后期和末期）和胞质分裂，一个母细胞产生两个遗传上完全相同的子细胞。在有丝分裂过程中，复制后的姐妹染色单体发生凝缩（前期），并通过组装好的有丝分裂纺锤体的微管在其动粒上被捕获（前中期），进而被驱动至赤道板位置排列（中期），随后姐妹染色单体分离并被拉向相反的纺锤极，实现均等分配（后期）。两个子细胞通过基于肌动蛋白的收缩环的作用实现物理上的分离（末期和胞质分裂）。动粒是一种特化的蛋白质结构，组装于染色单体的着丝粒区域，作为纺锤体微管的附着位点。其主要功能是介导染色体的捕获与排列，并协助纠正错误的纺锤体微管连接，同时参与调控纺锤体组装检验点，以确保染色体分离的保真性^3,4。

细胞同步化技术是研究细胞周期进程中分子和结构事件的理想工具。该方法可用于富集处于特定阶段的细胞群体，以进行多种类型的分析，包括基因表达谱分析、细胞生化过程分析以及蛋白质亚细胞定位检测。同步化的哺乳动物细胞不....

方案

1. 双胸腺嘧啶阻断与释放：试剂制备

1. 配制500 mL添加有10%胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
2. 将胸苷溶于无菌水中，配制成100 mM的储存液，分装后于-80 °C保存。

2. 有丝分裂进程的固定细胞成像方案（图1A）

1. 第1天，接种约2 x 10⁵ 将HeLa细胞接种至含盖玻片（经70%乙醇和紫外照射灭菌）的6孔板中，每孔加入2 mL DMEM培养基。于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中培养24 h。₂.
2. 1^st 胸苷阻断：第2天，将所需体积的胸苷充分混入新鲜DMEM培养基中（100 mM 储存液，终浓度为2 mM）。
3. 向6孔板中每个孔的细胞加入2 mL含胸腺嘧啶的培养基，孵育18 h。
4. 第3天，吸除培养基，用2 mL 1×PBS洗涤细胞两次，再用新鲜预热的DMEM洗涤一次；将细胞置于新鲜预热的DMEM培养基中培养9小时，以解除细胞阻滞。
5. 2^nd 胸苷阻断：向6孔板中每孔细胞再次加入2 mL含胸苷的培养基（终浓度为2 mM）。
6. 继续孵育18小时。
7. 第4天，吸除培养基，用2 mL 1× P....

结果

双胸苷阻断释放后固定细胞中分裂进程与微管稳定性的研究
Cdt1 参与 G1 期 DNA 复制起点的许可。它在 S 期被降解，但在 G2/M 期重新积累。为了研究其在有丝分裂中的作用，需要利用最合适的细胞同步化技术——双胸腺嘧啶阻断法，特异性地在 G/M 期耗尽内源性 Cdt1。¹⁵细胞在从第2次释放后立即转染siRNA^nd 胸腺嘧啶核苷阻断法，用于使细胞停留在S期，此时G1期中复制起点的许可过程（该过程也需要Cdt1功能）早已完成。通过Western印迹法验证了转染siCdt1并经双重胸腺嘧啶核苷阻断释放9小时后Cdt1的耗竭情况（图1B）。在双胸苷阻断释放后9小时固定细胞，结果显示对照组和转染Cdt1 siRNA的细胞中大多数均处于中期阶段。而在双胸苷阻断释放后10小时固定细胞时，结果显示大多数Cdt1 siRNA处理的细胞仍停滞在晚前期阶段，而对照组细胞则如期进入后期，并正常分离染色体（

讨论

双胸苷同步化最关键的优点在于，它可在短时间内获得大量有丝分裂细胞样本，且其中许多细胞同步进入有丝分裂期，从而能够更高效地分析染色体排列、双极纺锤体形成以及染色体分离过程。

许多调控蛋白复合物和信号通路都致力于确保有丝分裂的正常进行，而该过程的失调可能导致肿瘤发生。通过对稳定表达mCherry-H2B和GFP-微管蛋白并从双胸苷阻断释放的HeLa细胞进行活细胞成像显示，大多数对照细胞在核膜破裂（NEB）后约60分钟内进入后期并完成染色体分离（图3B）。另一方面，对Hec1功能受到干扰的HeLa细胞进行活细胞成像显示，大多数细胞长时间停滞在有丝分裂期，伴有染色体排列异常，随后进入后期或发生凋亡（图3C）。

过量胸腺嘧啶可抑制S期的DNA合成，从而将细胞阻滞在G1/S期¹¹。尽管双胸腺嘧啶阻滞同步化是细胞周期和有丝分裂进程研究中最常用的方法，但仍需注意该方法存在的一些.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092	4 °C 下保存
DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144	4 °C 下保存
Leibovitz’s (1x) L-15 培养基	Life Technologies	21083-027	4 °C 下保存
血清减量培养基（Opti-MEM）	Life Technologies	319-85-070	4 °C 下保存
青霉素和链霉素	Life Technologies	15070-063 (Pen Strep)	1:1,000 稀释
Dharmafect2	GE Dharmacon	T-2002-02	4 °C 下保存
胸苷	MP Biomedicals LLC	103056	溶于无菌蒸馏水
Cdt1 siRNA	Life Technologies		参考文献 10
Hec1 siRNA	Life Technologies		参考文献 13
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小鼠抗-磷酸化-γH2AX (Ser139) 抗体	Upstate Biotechnology	05-626, 克隆 JBW301	1:300 稀释
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Rodamine Red-X	Jackson ImmunoResearch		1:250 稀释
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