組換えプロトタイプ フォーミー ウイルス インテグラーゼ タンパク質は精製時に細菌ヌクレアーゼと頻繁に汚染されています。このメソッドは、ヌクレアーゼの混入を識別し、酵素の最終的な準備から削除します。
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この記事について
サマリー
要約
レトロ ウイルス プロトタイプ フォーミー ウイルス (PFV) のインテグラーゼ (IN) タンパク質は、レトロ ウイルスの統合のメカニズムを研究するためのモデル酵素です。他のレトロ ウイルスからのに比べて、PFV ではより水溶性と実験操作に向いています。さらに、臨床的に関連するひと免疫不全ウイルス (HIV-1) の阻害剤、PFV での触媒機構がウイルス相補的 DNA (cDNA) ターゲットの共有結合に参加する HIV 1 インチのすることに似ていることを示唆しているに敏感です。プロセスの DNA では、ストランドの転送と呼ばれます。この鎖転移反応は、ターゲット DNA にニックを紹介します。統合反応生成物の分析は、同様にニック DNA 核酸の存在によって混同することができます。細菌ヌクレアーゼは、組換え PFV のエシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) 単位で共同浄化するために示されています。ここでヘパリン親和性クロマトグラフィーによる汚染のヌクレアーゼから PFV を分離する手法について述べる。分数は、スーパーのプラスミドと agarose のゲルの電気泳動のヌクレアーゼの混入のため簡単に上映されます。PFV および汚染のヌクレアーゼは、ヘパリン セファローズ統合の一括生化学的または単一分子解析に適した遺伝子組換え PFV のヌクレアーゼ フリーの準備を許可するため代替の親和性を表示します。
概要
蛋白質 DNA 相互作用の生化学的および単一分子の研究は、非常に純粋な組換えタンパク質を必要とします。これらのアッセイの結果を隠すことが汚染細菌の核酸分解酵素。汚染ヌクレアーゼは、組換えタンパク質酸素スカベン ジャー プロトカテク酸--3, 4-ジオキシゲナーゼ (PCD) とエシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌)1から分離したプロトタイプ フォーミー ウイルス (PFV) インテグラーゼ (IN) の準備で発見されています。,2,3。
レトロ ウイルスの統合の試金は、活動4の対策としてスーパー コイル DNA の刃こぼれしたりリニア製品への変換に依存します。細胞の感染ではウイルスの cDNA の 2 つの端をホスト クロマチン5に結合します。反応に参加する各端は、ストランドの転送と呼ばれます。アッセイの組換えの活動参加 2 つの DNA オリゴマー協調統合反応4,5,6
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プロトコル
1. 誘導 PFVエシェリヒア属大腸菌に表現で
-
大腸菌BL21(DE3) pLysS の 20 μ L に PFV の発現プラスミド (10 ng/μ L) の 1 μ L を追加 (市販の細胞の 20 μ 因数が > 2 × 106 CFU/μ g のプラスミド) 1.5 mL チューブに。指タップまたはフリック チューブでそっと混ぜます。孵化で氷の 5 分。
- まさに 30 衝撃を熱 42 ° C の水のお風呂と 2 分間氷にすぐに戻ります。
- カタボライト抑制 (SOC) メディアで室温超最適スープの 80 μ L を追加します。225 回転/分 (rpm) 揺れと 37 ° C で 1 時間インキュベートします。
- 100 mm × 15 mm シャーレ ルリア スープ (LB) 寒天の 25 mL を含む混合物の 25 μ L をプレート (1 L LB 寒天: 15 g 寒天 10 g 食塩 5 g 酵母エキス、バクト トリプトン 10 g) と 100 μ g/mL アンピシリン (100 mg/mL 原液)。
- 第 2 同一プレート上の変換セルの残りの 75 μ L をプレートします。37 ° C で一晩を蓋板を孵化させなさい
- プ....
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結果
組換え PFV でしばしば細菌ヌクレアーゼ1で汚染されています。生化学的統合の試金はスーパー プラスミド DNA のリラックスした円とリニア製品への変換の量子化によって異なります。これらのアッセイのスプリアス定量汚染ヌクレアーゼの存在可能性があります。Hexahistidine タグを持つ PFV での式はエシェリヒア属大腸菌(図 1) に誘導される、まずニッケルのアフィニ ティー ・ クロマトグラフィー (図 2) で精製します。ほぼ純粋な PFV の分数を組み合わせるし、hexahistidine タグがプロテアーゼにより切断されます。PFV のと汚染のヌクレアーゼにヘパリン セファローズ クロマトグラフィー (図 3)1の異なる親和性があることを定めています。次のヘパリン セファローズ クロマトグラフィー PFV の分数はリラックスしたサーク.......
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ディスカッション
DNA 修復タンパク質 1 分子顕微鏡アプリケーション、またはレトロ ウイルス integrases の酸素スカベン ジャーなど DNA と相互作用する組換えタンパク質は汚染細菌核酸2,3の無料する必要があります。これらの汚染物質は、一括生化学的または単一分子アッセイ中に結果の解釈を混乱させるかもしれません。
我々 は、細菌のヌクレアーゼ頻繁共同浄化 PFV インチで発見しました。ただし、PFV のヌクレアーゼの細菌汚染物質1と容易に区別がヘパリン セファローズに親和性が表示されます。ヌクレアーゼ フリー PFV の調製に重要な各分画ヘパリン セファローズから次のグラジエントのヌクレアーゼ活性の注意深い定量です。グラデーションはヌクレアーゼ汚染; から PFV の分離を許可するように十分に浅いである必要があります。急な勾配は、効率的な分離と互換性がないでしょう。さらに、プラスミド DNA 基板ヌクレアーゼ アッセイの背.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品は、NIH の AI099854 とキーに AI126742 によって支持されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| BL21/DE3 ロゼッタ 大腸菌 | EMD ミリポア | 70956-4 | |
| LB ブロス | EMD バイオサイエンス | 1.10285.0500 | |
| アンピシリン | アムレスコ | 0339 | |
| クロラムフェニコール | アムレスコ | 0230 | |
| PBS | シグマ アルドリッチ | D8537 | |
| IPTG | デンビルサイエンティフィック | CI8280 | |
| ZnCl2 | シグマ-アルドリッチ | 208086 | |
| トリス超高純度 | ゴジラファインケミカル | ズUTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| PMSF | アムレスコ | 0754 | |
| イミダゾール | シグマ・アルドリッチ | I0250 | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| アガロース | デンビルサイエンティフィック | CA3510 | |
| エチジウムブロマイド | サーモフィッシャーサイエンティフィック | BP1302 | |
| グリセロール | フィッシャーサイエンティフィック | G37-20 | |
| Ni-NTA スーパーフロー | キアゲン | 30430 | |
| ヘパリンセファロース 6 ファストフロー | GE ヘルスケア ライフサイエンス | 17-0998-01 | |
| HRV14 3C プロテアーゼ | EMDケミカルズ | 71493-3 |
参考文献
- Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease....
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再版と許可
