العمليات النمائية مثل الانتشار، والهجرة، وثمرة نورت هي غالباً بالقلق في الأمراض العصبية. وبالتالي، فإننا نقدم بروتوكولات لتقييم سرعة وتكاثر هذه العمليات النمائية في الشخصيات البشرية المستمدة من اللجنة التوجيهية. كما تسمح هذه البروتوكولات تقييم آثار عوامل النمو ذات الصلة والمداواة في التنمية للمجلس الوطني.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكشف السريع عن النماء العصبي تعمل في خلايا الإنسان العصبية السلائف (الشخصيات)
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
عائدات التنمية الدماغ البشري من خلال سلسلة من عمليات مدبرة تحديداً، مع المراحل السابقة المتميزة بالانتشار، والهجرة، وثمرة نورت؛ والمراحل اللاحقة التي تتميز بتكوين ثمرة والمشبك إكسون/تغصن. في الاضطرابات النمائية، غالباً ما واحد أو أكثر من هذه العمليات تتعطل، مما يؤدي إلى تشوهات في تكوين الدماغ ووظيفة. مع ظهور التكنولوجيا البشرية المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (هيبسك)، أن الباحثين الآن وفرة من الخلايا البشرية التي يمكن أن تكون متباينة في تقريبا أي نوع من الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية. يمكن استخدام هذه الخلايا لدراسة تطور الدماغ العادية والمرضية المرض. يميز عدد من البروتوكولات باستخدام هيبسكس نموذج استخدام الأمراض العصبية الميؤوس من شفائهم للخلايا العصبية أو استخدام الثقافة 3D النظم تسمى أورجانويدس. في حين أثبتت هذه الأساليب لا تقدر بثمن في دراسة الأمراض البشرية المرضية، هناك بعض العيوب. التفريق بين هيبسكس في الخلايا العصبية وجيل من أورجانويدس هي طويلة ومكلفة من العمليات التي يمكن أن تؤثر على العدد من المتغيرات التي يمكن تقييمها والتجارب. وباﻹضافة إلى ذلك، بينما تسمح الخلايا العصبية بعد الانقسامية وأورجانويدس دراسة العمليات المتعلقة بالمرض، بما في ذلك ثمرة تغصن وسينابتوجينيسيس، يحول دون دراسة العمليات السابقة مثل الانتشار والهجرة. في الاضطرابات النمائية، مثل مرض التوحد، تشير أدلة وافرة على الجثة والوراثية إلى العيوب في العمليات الإنمائية المبكرة. قد تكون الخلايا العصبية السلائف (الشخصيات)، وعدد سكانها خلية التكاثري عالية، نموذج مناسب لطرح أسئلة حول عمليات موسمية وبدء المرض. الآن نتقدم بمنهجيات المستخلصة من دراسة التنمية في الثقافات القشرية الماوس وفار للشخصيات البشرية. استخدام الشخصيات يسمح لنا بالتحقيق تعمل المتعلقة بالمرض وتحديد مدى اختلاف المتغيرات (مثلعوامل النمو والمخدرات) أثر العمليات الإنمائية بما في ذلك الانتشار، والهجرة، والتمايز في بضعة أيام فقط. في نهاية المطاف، يمكن استخدام مجموعة أدوات هذا بطريقة استنساخه والفائق للتعرف على الآليات الخاصة بالمرض وتعمل في الاضطرابات النمائية.
المقدمة
استخدام أبسط الكائنات الحية ونماذج الفأر قد توضيح آليات نمو الدماغ الأساسية، فضلا عن منشأ المرض. وعلى الرغم من أوجه التقدم هذه، لا يزال مسببات العديد من الاضطرابات العصبية بعيد المنال لأن ليس كل النتائج التي توصل إليها في أبسط الكائنات ذات الصلة المباشرة بالجوانب المعقدة للأمراض البشرية. علاوة على ذلك، درجة أكبر من التعقيد في الدماغ البشري غالباً ما يجعل من الصعب لنموذج التنمية البشرية واضطرابات في الحيوانات. ومع تطور وتقدم البشرية المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (هيبسكس) التكنولوجيا، يمكن برمجتها في الخلايا الجذعية خلايا جسدية وثم متباينة داخل الخلايا العصبية لدراسة الأمراض البشرية. التقدم في تكنولوجيات هيبسكس و "أوميك" (علم الجينوم، ترانسكريبتوميكس، البروتيوميا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-سلامة الإجراءات وصيانة السلامة الأحيائية مجلس الوزراء
-
إجراءات السلامة في مستوى السلامة الحيوية-2 (BSL-2)
- اتبع المبادئ التوجيهية لهذه المؤسسة في العمل مع المواد BSL-2. التخلص من المواد BSL-2 وفقا للممارسات للمؤسسة. وتشير إلى الغرف والمعدات المستخدمة لمواد BSL-2. ارتداء جميع معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية)، بما في ذلك مختبر المعطف والقفازات.
-
صيانة السلامة الأحيائية مجلس الوزراء
- استخدام خزانة السلامة الأحيائية معتمدة لاستخدام مواد مستوى BSL-2.
- تشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء لمدة 15 دقيقة على الأقل، ومن ثم رش الأسطح بمحلول ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الهدف من هذه الدراسات تحديد النشاط التكاثري للشخصيات، وهي زيادة في إعداد الخلايا. ويتحقق ذلك بتقدير تركيب الدنا من خلية إجمالي السكان، نهجاً الفائق الذي يقيس إدماج thymidine تريتياتيد المشعة التتبع في مقتطفات الخلية، ويعكس جميع خلايا تعمل في مرحلة ثانية، سواء كانوا توليف لمدة 5 دقائق أو ساعتين كاملة. بالإضافة إلى ذلك، تسمح هذه الاختبارات لتحديد نسبة الخلايا التي تدخل المرحلة S وأرقام مجموع الخلية، مقايسة كثيفة العمالة أكثر من الخلايا المفردة. خلايا توليف الحمض النووي في المرحلة S، خطوة ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
البروتوكولات المقدمة هنا توضيح طرق سريعة وبسيطة دراسة العمليات النمائية الأساسية واختبار عوامل النمو والعقاقير استخدام الخلايا السليفة العصبية المشتقة من هيبسك. وثورة التكنولوجيا هيبسك دراسة الآلية المرضية للأمراض العصبية النمائية بتزويدنا بالوصول غير مسبوق يعيش الإنسان الخلايا العصبية من الأفراد المتضررين. وفي الواقع، كانت هناك العديد من الدراسات هيبسك من الاضطرابات النمائية، بما في ذلك متلازمة ريت، متلازمة تيموثي، متلازمة X الهشة، وانفصام الشخصية، الذي اكتشف الانحرافات الخاصة بالمرض في dendrites، سينابسيس، والخلايا الع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
شكر وتقدير
هذا العمل كان يدعمها مجلس حاكم ولاية نيو جيرسي للبحوث الطبية والعلاج من مرض التوحد (CAUT13APS010؛ CAUT14APL031؛ CAUT15APL041)، لوري نانسي يمثل مؤسسة الأسرة، والمبرات تؤدي ميندوركس، ومؤسسة الجالية اليهودية من أكبر مترويست نيوجيرسي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| وسيط الحث العصبي PSC: رابط بروتوكول : https://goo.gl/euub7a ؛ | ThermoFischer | Scientific A1647801 | هذه مجموعة تتكون من وسيط Neurobasal (NB) ومكملات تحريض عصبي 50x (NIS). يستخدم NIS لصنع 1X الحث العصبي المتوسط و 100٪ متوسط التمدد |
| المتقدم DMEM / F12 | ThermoFischer Scientific | 12634-010 | مكون 100٪ من التوسع |
| المتوسط العصبي القاعدي | المتوسط ThermoFischer | 21103049 | لكل من NIM و 100٪ وسيط التمدد ؛ |
| Matrigel Corning المؤهل من hESC | 354277 | جل مقلد مصفوفة خارج الخلية مؤهل من hESC (جل مقلد ECM) ؛ | |
| Y-27632 (2HCl) ، 1 مجم | تقنيات الخلايا الجذعية | 72302 | مثبط الصخور |
| 6 ألواح آبار ألواح | البوليسترين Corning | COR-3506 | المستخدمة لصيانة NPC وفحص هجرة الغلاف العصبي ؛ |
| 24 لوحة بئر | ThermoFischer Scientific | 2021-05 | ألواح البوليسترين: تستخدم في مقايسة تخليق الحمض النووي NPC |
| أطباق 35 مم | ThermoFischer Scientific | 2021-01 | ألواح البوليسترين: تستخدم لدخول NPC S-phase ومقايسة Neurite |
| للفأر الطبيعي Laminin | Invitrogen | 23017-015 | الركيزة لألواح الطلاء: تستخدم لتخليق الحمض النووي NPC ، ودخول المرحلة S ، وفحوصات |
| رقم الخليةالركيزة Fibronectin | Sigma | F1141 | لألواح الطلاء: تستخدم لفحص Neurite ؛ |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | الركيزة لطلاء ألواح |
| البنسلين / الستربتومايسين | ThermoFischer المضاد | الحيوي العلمي 15140122 ، مكون من NIM ، 100٪ توسع و 30٪ وسائط التوسع ؛ | |
| StemPro Accutase | Gibco | A11105-01 | 1X حل انفصال الخلية |
| 2.5٪ تريبسين (10X) | Gibco | 15090-046 | 10X محلول إنزيمي |
| 0.5 M | EDTA ThermoFischer Scientific | AM9261 | يستخدم في محلول التربسين لرفع الخلايا لمقايسة تخليق الحمض النووي |
| [3< / sup>H] -ثيميدين | بيركينإلمر | NET027E001 | التريتيوم المشع ، ثايميدين |
| فيشربراند 7 مل قوارير تلألؤ HDPE | فيشربراند | 03-337-1 | قوارير لعد التلألؤ السائل |
| EcoLite (+) | MP Biomedicals | 0188247501 ؛ | كوكتيل التلألؤ السائل |
| LS 6500 عداد التلألؤ السائل متعدد الأغراض | بيكمان كولتر | 8043-30-1194 | عداد التلألؤ السائل |
| Skatron حصادة الخلايا شبه الأوتوماتيكية نوع 11019 | الأجهزة الجزيئية & شركة سكاترون إنسترومنتس. | حصادة الخلايا شبه الأوتوماتيكية | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor & reg ؛ 488 مجموعة التصوير | ThermoFisher Scientific | C10337 | EdU ومجموعة تلطيخ لمقايسة دخول المرحلة S |
| Trypan Blue Solution ، 0.4٪ | ThermoFisher | Scientific 15250061 | تقييم جدوى الخلايا |
| ورق ترشيح GF / C | GE Healthcare Life Sciences ، Whatman | 1822-849 | ورق ترشيح من الألياف الزجاجية |
| عامل النمو البشري الأساسي FGF-2 | Peprotech | 100-18B | النمو |
| الغدة النخامية الأدينيلات سيكلاز تنشيط بولي ببتيد (PACAP-38) | BACHEM | H-8430 | الببتيد العصبي |
المراجع
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
