Методическая статья

Сократительную способность измерения человеческого гладких мышц матки для разработки лекарственных средств помощи

20.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56639

⸱

26 января 2018 г.

 ,  ,  , 
1Harris-Wellbeing Preterm Birth Research Centre, Department of Cellular and Molecular Physiology, Institute of Translational Medicine, University of Liverpool, 2School of Biomedical Sciences, The University of Queensland, 3Faculty of Chemistry, Institute of Biological Chemistry, University of Vienna, 4Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland, 5Center for Physiology and Pharmacology, Medical University of Vienna

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Эта статья описывает экспериментальные протоколы для изучения ex vivo сокращений человека миометрия и их применение в лекарственных препаратах. Этот метод используется для улучшения понимания миометрия физиологии и патофизиологии также относительно проверки фармакологическим данным Роман исследований зондов или наркотиками ведет.

Аннотация

Открытие и характеристика новых фармацевтических соединений или биохимических зонды полагаются на надежной и физиологически соответствующего анализа систем. Мы описываем методы измерения ex vivo сократительную способность миометрия. Этот assay может использоваться для выявления факторов и молекул, участвующих в модуляции сокращения миометрия и определить их возбуждающим или ингибирующего действия и поэтому их терапевтический потенциал в естественных условиях. Биопсия получаются из женщин доставки кесарева сечения с осознанного согласия. Тонкой полоски миометрия расчлененный, обрезается и придает силы датчика в пределах 1 мл орган бани superfused раствором физиологического раствора при температуре 37 ° C. Полоски развивать спонтанное сокращений в течение 2-3 ч при установленной напряженности и остаются стабильными в течение многих часов (> 6 ч). Полоски могут также стимулировать заключать такие как эндогенных гормонов, окситоцин и вазопрессин, которые вызывают сокращение частотой модуляции концентрации зависимых, силы и продолжительности, чтобы больше напоминают схватки в труде. Следовательно эффект известных и роман наркотиков ведет могут быть проверены на спонтанных и индуцированных агонист схватки.

Этот протокол конкретно подробности, как этот assay может использоваться для определения потенции агентов, известных и Роман путем измерения их воздействия на различные параметры сжатия человека миометрия. Мы используем окситоцина - и V1a антагонисты рецепторов, атозибана и SR49059 как примеры известных соединений, которые подавляют окситоцина и вазопрессина индуцированной схватки и продемонстрировать, как этот метод может использоваться для дополнения и подтверждения Фармакологические данные, полученные на основе ячеек анализов для разработки лекарств. Можно также охарактеризовать последствия Роман агонисты по сравнению с окситоцина и вазопрессина. Хотя мы используем пример окситоцина / системы вазопрессина, этот метод также может быть использован для изучения других рецепторов и ионные каналы, которые играют определенную роль в сокращения матки и релаксации для углубления понимания человека матки физиологии и патофизиологии.

Введение

Цель лекарств является производить роман, мощным и высокоселективных лиганды, которые генерируют терапевтические реакции активации или ингибирования клеточной сигнализации пути. Это требует соответствующего анализа системы, в которой для проверки соединений свинца с надежная, устойчивая и соответствующих решений1. Фармакологические методы, такие как Связывание лиганда рецепторов и функциональные анализы часто используют гетерологичных систем, основанных на клетки, в инженерии с overexpress рецепторами, которые в противном случае не будет настоящей2. Хотя эти методы предоставляют ценную информацию для рецепторов фармакологии и начале разработки лекарственных средств, полученные данные могут не отражать истинный в vivo сценарий. Поэтому важно, что фармакологические данные из ячейки на основе анализов также проверяются в физиологически соответствующих моделей.

Гладкие мышцы матки (миометрия) представляет собой мышечный слой матки, которая отвечает за сокращений во время схваток, которые излечению и расширяются шейки матки и доставить плода3. Сокращения миометрия спонтанное; она не требует гормональной и нервной ввода для контракта4. Сокращений вызванных спонтанной деполяризации мембраны клеток миометрия которой приводит к открытию напряжение работает Ca2 +-каналы (каналы L-типа) и приток Ca2 + в клетки5. Кальция комплексы с Кальмодулин и активирует лёгкие цепи киназы миозина, который в свою очередь фосфорилирует миозина, позволяя пересеките мост цикла формирования с актина и сокращение. Релаксация обычно опосредовано де фосфорилирование миозина, миозин фосфатазы и снижением концентрации Ca2 + через экструзии из клетки и/или поглощения в саркоплазматический ретикулум (SR)5,6 ,7.

Несколько методов были разработаны для изучения миометрия функции и дисфункции, от внутренних и внешних Токография в естественных условиях и катетеры внутриматочного давления, для генерации превращается или увековечен клеток миометрия происхождения8 ,9,10,,1112. Хотя систем культуры клеток может обнаружить, является ли вещество может действовать на клеточном уровне, полоски ткани внутри бани орган может использоваться как инструменты для измерения функциональных ответы на фармакологические реагентов вся тканей. Ванна традиционный орган обычно является большой подогревом стекло камеры, которая способна холдинга между 5 и 50 мл физиологического раствора (PSS). Полосы в эти большие камеры обычно требуют аэрации кислородом и больших объемов PSS. Полоски ткани расчлененные и приостановлено в зале купания и придает силы датчика, который измеряет изменения напряженности, такие, как во время спада. Полос миометрия от людей и животных, включая, морская свинка13, мыши14, крыса15, кролик16и другие17,18, были использованы для изучения ряда исследовательских групп Многие вопросы, касающиеся миометрия физиологии и патологии, в том числе недоношенных и неблагополучных трудов. К примеру, миометрия полосы были использованы для определения факторов, регулировать и изменять миогенных деятельности19,20,21, определить функции органеллы, например SR22, а также расследование модуляторы иона каналов23,24,25,26, насосы и теплообменников27 определить их роль в физиологии миометрия.

Эта техника ex vivo для оценки работы сокращения тканей и прямое действие различных агентов на параметры сжатия позволяет измерить включая, сокращение сил (силы), частота и продолжительность, а также интеграция этих значений, чтобы создать индекс общей работы, проделанной (среднее неотъемлемой силой или площадь под кривой, AUC). Как подготовки газа изолированы ткани представляет собой модель более одного типа клеток, физиологическая реакция всей ткани могут быть измерены. Ванна органа и изолированные ткани полосы поэтому являются полезным инструментом в обеспечении мост между работой культуры клеток и весь животныхв естественных условиях работы. Таким образом, в области лекарственных препаратов, последствия новых агентов с точки зрения их возбуждающих (т.е., стимулирования) или тормозящее (то есть, релаксация) потенциал в естественных условиях могут быть более тесно оценены. Этот метод был успешно используется в разработке окситоцина - и V1a-атозибан антагонист рецепторов (OTR и V1aR) как токолитическими подавляют преждевременных родов схватки и задержки преждевременных родов. В vitro тестирование атозибан на миометрия полоски нашли антагониста удалось значительно сократить окситоцина (OT)-индуцированной схватки28,29,30. Важно эти исследования помогли проверить трансляционная значение атозибана и созданных доказательства в концепция данных необходимо принять ее вперед до клинических испытаний31,,3233,34 . Атозибан теперь широко используется как препарат выбора для задержки труда в Европе. Для аналоговых карбетоцина окситоцина показать свой терапевтический потенциал в предотвращении послеродовое кровотечение35,,3637были проведены аналогичные доказательства в концепция исследования. Другие соединения свинца в настоящее время в стадии разработки с этот assay включают38 retosiban (GSK221149A) и nolasiban (неопубликованные данные). Эти методы также были успешно использованы для сравнения между группами пациентов39,40,41,42,,4344, 45,,4647 и изучить для intra Межвидовые различия.

Здесь мы описываем использование изолированных ex vivo полоски ткани от беременных человека миометрия в малых (1 мл) по заказу органа ванны для иллюстрации того, как этот метод может использоваться для дополнения и подтверждения фармакологических данные, полученные на основе ячеек анализов . Биопсия основном были получены из женщин проходят заранее труда планового кесарева сечения (CS) доставки, как они являются запланированные операции и, следовательно, легче планировать биопсии коллекции, имеют легкий доступ к миометрия и тканей не будут подвержены любому утеротоника стимуляторов или миорелаксанты до операции. Однако биопсии могут быть получены также доставку (аварийный) CS в условии, что имеется достаточно времени для полного согласия пациента труда женщин. Большинство биопсий получаются во время операции из нижнего сегмента матки на сайте хирургический разрез, однако это также можно получить образцы из верхнего сегмента48,49. В некоторых случаях после вагинальных родов удар биопсий из плацентарной кровати также были получены50. Однако это не самые обычные маршрут и количество ткани миометрия получены невелика. Non беременных миометрия могут быть получены до или после менопаузы женщины проходят гистерэктомия для доброкачественных гинекологических заболеваний. Полная толщина биопсия является пробы после Патоморфологическое исследование, от нижней корпус от шейки матки, и миометрия берется из середины стенке матки, избегая поверхности серозных и эндометрия.

Протокол

Совет и безопасности утверждения соответствующие организационные, этические обзор для экспериментов с тканями человека должны быть на месте перед началом работы с любой ткани человека. Все описанные здесь получил одобрение от местных исследований этического Комитета (Ливерпуль Восток, РЭЦ Ref 10/H1002/49) и институциональный обзор советов научных исследований и развития Департамента, Ливерпуль женщин больницы и Ливерпульского университета.

Примечание: Все биопсии, указанных в настоящем протоколе были получены из женщин предварительно труда, выборные CS доставки в Ливерпуль Женская больница и каждая женщина дал письменное информированное согласие на участие.

1. решения

  1. Подготовить измененный Кребс физиологического раствора раствор (PSS) в следующем составе: 154 мм NaCl, 5,6 мм KCl, 1,2 мм MgSO4, 7.8 мм глюкозы, 10,9 мм HEPES и 2,0 мм CaCl2.
    Примечание: Объем следует определяется количество ткани бани в операции, скорость потока системы (1 мл/мин) и оценкам продолжительность эксперимента, включая время уравновешивания и размыва.
  2. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4, используя 4 M NaOH.

2. Ткань ванна Настройка

  1. Разогрейте ткани Ванна системы водохранилища до ~ 45 ° C с использованием рециркуляционный водяной бане на 55-60 ° C.
    Примечание: Резервуар для воды в основание прибора нагревается до ~ 45 ° C, который после позволяя для теплообмена с PSS перистальтические трубы, проходящей через, гарантирует, что PSS в ванне ткани при 37 ° C. Некоторые настройки для задания температуры могут быть необходимы для обеспечения PSS ткани бане Температура 37 ° C. Это будет варьироваться в зависимости от аппарата используется и значение скорости потока.
  2. Вручную переключиться на другое необходимое оборудование, включая усилитель, сбора данных и запись системы и насосы.
  3. Позиция каждого перистальтические входное отверстие (одна трубка ванна) вокруг ролики перистальтического насоса. Безопасная с сохраняя останавливается и ужесточение камеры сжатия и блокировка ключей вокруг трубы. Поместите свободные концы труб перистальтические фидер в 1 Л контейнер PSS и запустите насос, чтобы позволить PSS для постоянно perfuse в ткани ванны.
  4. Обеспечить насосы работают правильно и что уровень раствора в ванне является постоянным, таким образом, что скорость потока в ванну равно скорость удаления. Уровень PSS в ванне ткани может быть отрегулирован манипулирования глубина всасывающую трубу в ванне с помощью моделей глины.
  5. Калибровка датчики силы, поместив известный вес (эквивалент 1 миллиньютон (mN, единица силы)) на крюк датчика и записи прогиб, обнаружены приобретение программного обеспечения.
    Примечание: Значения может корректироваться в программном обеспечении, таким образом, что значения автоматически преобразуются в mN, отрицая необходимость выполнения любых дальнейших преобразований во время анализа. Калибровка датчиков силы должны быть выполнены перед установкой ткани.

3. Подготовка тканей и рассечение полос

  1. Соберите биопсий беременных человека миометрия (1 – 2 см3) в CS после рождения ребенка и плаценты. Получите (типичный) полная толщина биопсий, в которых присутствуют периметрии (внешняя serosa слоя матки) и Европейская (внутренний слой матки). Используйте только миометрия ткани (Центральный мышц слоя). Смотрите Рисунок 1A-B.
    1. Удалите (существенные) Европейская и любой адэрентных плода мембраны (если присутствует), а эти ткани, как известно, производят вещества, которые могут изменить сократительную способность миометрия.
      Примечание: В хирургии, образцы помещают в Хэнкс сбалансированный соли раствора (HBSS) или свежие PSS и хранить при 4 ° C. В идеале тканей следует использовать в течение 12-16 h хирургии, однако исследования показали без ущерба для сократимости после 18 h коллекции с хранения на 4 ° C51. Соответствующие элементы управления должны быть выполнены для подтверждения жизнеспособности тканей и функции после длительного хранения при 4 ° C. От верхнего края нижнего сегмента матки разрез сайта и не от верхнего сегмента, берутся образцы здесь. Было показано, что нижних и верхних сегментов матки контракта аналогичным образом48, следовательно нижнего сегмента биопсий считаются хорошим отражением деятельности верхнего сегмента миометрия.
  2. Подготовьте рассечение области и необходимых документов, в том числе: большой Рассечение ножницами, маленькие ножницы рассечения беззаботными, два рассечения щипцы, рассечение булавки и алюминия ткани клипы, вокруг рассечение микроскоп с обоими фиксированной и масштабирования увеличение.
  3. Место биопсии образца на четкой основе силастиковых рассечение блюдо (см. Таблицу материалы) заполнены с PSS и тщательно ориентироваться биопсии, так, что края serosa и decidua идентифицируются Рисунок 1B.
  4. Используйте контакты для обеспечения биопсии к основанию блюдо. Убедитесь, что ткань остается увлажненной с PSS на протяжении всего процесса рассечение.
  5. Вручную переключиться на источнике света микроскоп и осмотрите ткани под микроскопом при 10-кратном для идентификации регионов миометрия свободной от рубцовой ткани, serosa, Европейская и любой адэрентных плода мембраны, если он присутствует.
  6. Выполняйте тупым рассечение, большие Рассечение ножницами для разделения двух слоев прилегающих тканей, раскрывая двух самолетов или листы мышцы.
    Примечание: Это часто легче найти небольшой карман между слоями ткани начать разделения, но необходимо позаботиться о том, чтобы избежать малых судов на краю биопсии, как они могут быть ошибочно приняты за «карманы».
  7. Место для обеспечения его рассечения булавки на каждом углу ткани. Осмотрите листы мышц, ищет регионов мышц с волокнами, параллельно.
    Примечание: Регион идентификации можно опираясь на следующие направления мелких капилляров, perfusing через ткани. Нежный потянув на краю ткани может также помочь определить направление, в котором едут волокна.
  8. Отрезать полоски ткани ~ 2 мм широкий x 8 длиной мм x 1 мм вдоль продольной оси, в соответствие с направлением мышечных волокон, с помощью малых Рассечение ножницами.
    Примечание: Ухода должны быть приняты только провести ткань первоначального среза, чтобы избежать повреждения.
  9. Повторите этот процесс для того чтобы рассечь количество требуемых полос для эксперимента.
  10. Закрепите каждую полосу на обоих концах для выпрямления и закрепите на блюдо, стараясь не над стрейч ткани.
  11. Прикрепить алюминия ткани клипы на каждом конце, так что ткани между ними ~ 5 мм, долго и тщательно отрезать любые излишки ткани (рис. 1 c).
  12. Переезд в чистую тарелку, наполненный PSS, готовые для монтажа.

4. Монтаж тканей в бане

  1. Передача полоски в экспериментальной ткани бани. Смонтировать полосы горизонтально, не вертикально (как в традиционных орган ванны) (рис. 2B).
  2. Подключите один конец каждого газа на клип в силу преобразователя, который измеряет сужением ткани, и с другой фиксированный крюк в зале ткани.
    Примечание: Вместимость ванны ткани-~ 1 мл, который достаточно большой, чтобы убедиться, что полоски полностью погружать в ванну.
  3. Убедитесь, что полоски находятся на базе каждого крюк в ванне.
  4. Откройте программное обеспечение записи двойным щелчком на значке программного обеспечения.
  5. Настройте записи для каждого канала, так что это в виду в окне каналов.
  6. Изменить масштаб оси Y для чтения между 0-10 V (эквивалент 0-10 mN пост калибровки), щелкнув правой кнопкой мыши по оси Y, выбрав «масштаб» и ввод минимальное и максимальное значения 0 и 10, соответственно. Нажмите «OK». Повторите эти действия для каждого канала записи.
  7. Нажмите «запись» на программное обеспечение, чтобы начать живой записи.
    Примечание: Если полоски не защищены на основании каждого крюк, они могли бы скольжения во время спада, который будет отображаться как «паз» на запись. Установленной напряженности будет меняться, и поэтому после проскальзывания схватки могут отличаться.
  8. Натяжные ткани в каждой бане, вручную поворачивая микроманипуляторы, придает каждого датчика. Следовать за движением вверх ткани от базовой линии на экране и продолжают свою очередь микроманипуляторы, до тех пор, пока базовые напряженность достигает 0,2 г (~ 2 mN).
    Примечание: Ткани сразу же начнут потихоньку расслабляться (отмечено снижение напряженности базовых), обычно достигая постоянное напряжение между 0,5 – 1 млн. Это определенное напряжение была оптимизирована для полоски ткани такого размера в наших экспериментальных условиях. Если другие размера ткани должны быть использованы, важно, что соответствующие длины напряженность отношений расследования выполняются для оптимизации отдыха силы должен применяться.
  9. Разрешить тканях сбалансировать для ~ 2 h до тех пор, пока возникают спонтанно схватки.
    Примечание: обычно наблюдается небольшая высота базовой напряженности и является хорошим свидетельством жизнеспособности тканей и что она будет сократительной.

5. сложные ткани с калия 40 мм (высокая K+)

  1. Если не спонтанное схватки происходят после 2 h монтажа, вызов полоски с высоким содержанием калия раствор соли, в котором калия повышается до 40 мм, isosmotic замена NaCl на KCl. Для высокой K+, добавьте следующий (в мм): 119,6 NaCl, 40 KCl, 1.2 MgSO4, 7.8 глюкозы, 10,9 HEPES и 2.0 CaCl2.
    Примечание: В гладких мышцах например миометрия, применение высоких K+ вызывает сужение, косвенно открыв напряжения действовали кальциевых каналов, ведущих к максимальный приток Ca2 + в клетки ткани. Высокий K+ таким образом может использоваться в качестве меры для проверки общего индекса целостности тканей, а также достижения мера реакции максимальной ткани.
    1. Поместите загрузочную трубку для бани, содержащие газа будут оспорены в стеклянной бутылке лаборатории, содержащие высокий K+ для 1-2 мин.
    2. Возвращает входное отверстие в контейнер PSS.
    3. Там, где достигается в ответ на высокий K+ , продолжать следить за полосу для дальнейшего 1 ч. Если нет сократительной ответа до высокой K+ или не спонтанной активности вызвало сообщение высокой K+ ответ, отказаться от полосы.
      Примечание: Экспериментатор также необходимо быть в курсе Мертвое пространство (время, необходимое для решения для достижения Ванна ткани) подачи труб до оценки ответа на высокой K+. Это может занять 2-3 мин и будет зависеть от скорости потока.
    4. Для обеспечения полного смыва высокой K+ от ванной и подачи труб, которые могут повлиять на последующие маневров, подождать, пока спонтанное схватки вернуться к pre высокой амплитудой K+ прежде чем далее с экспериментом.

6. Тестирование воздействие известных и новых соединений на сокращения миометрия

Примечание: Эксперименты для проверки эффекта новых препаратов и реагентов на миометрия функции могут выполняться на спонтанное (рис. 3A) или агонист стимулирует схватки (рисунок 3B-C). Для агонистов стимулирует схватки, OT или аргинин-вазопрессина (VP) добавляется к PSS дать в концентрации 0,5 Нм и используется на протяжении всего эксперимента (рисунок 3B-C). Концентрация OT была оптимизирована для этот assay, как она обеспечивает схватки, которые фазовые в природе40,52. Концентрации агонисты больше, чем это может привести к длительный, устойчивый схватки (тонизирующий) (см. предложение41,44 для примеров), под которой трудно оценить эффект различных агентов и экспериментальной сроки необходимо значительно расширить для размещения увеличение продолжительности отдельных сокращений и снижения частоты. В этом примере эксперимент, OT VP добавляется или стимулировать схватки так что антагонизм известных OTR и антагонисты1aR V, атозибана и SR49059, или наш Роман соединения [D-Arg8]-inotocin ([D-Arg8] INT), могут быть оценены.

  1. Подготовить концентрации тест compound(s) в PSS (с или без 0,5 Нм OT/VP) разводят как минимум 1/1000 разрежения, обеспечивая широкий спектр концентраций включены, такие как те, которые не вызывают в ответ на концентрации, которые превышают максимальную ответ.
  2. Подготовьте набор эквивалентных разведений с участием равных объемах или транспортного средства (например, диметилсульфоксида, ацетонитриле, дистиллированная вода).
    Примечание: Это часто легче готовить самую высокую концентрацию, т.е., 10-6 М (со склада 10-3 М), а затем выполнить серийных разведений по логарифмической шкале (например, 10-6–10-10 М). Объем должен быть подготовлен зависит от времени приложения, скорость потока аппарата и количество полос должны рассматриваться, например, для 25 мин применение реагента и скорость потока 1 мл/мин, не менее 25 мл каждого концентрации в ткани Ванна крас Эд.
  3. Применить первый концентрация соединения тканей, помещая подачи труб для ванны ткани в стеклянной бутылке лаборатории, содержащие реагента на желаемой концентрации.
    Примечание: Это должно делаться после того, как достигается устойчивый базовых спонтанное или OT/VP-стимулирует схватки.
  4. Применить соответствующее решение управления транспортного средства в так же, второй ванной.
  5. Рекордное время приложения (т.е., когда было изменено подачи труб).
  6. Повторите этот процесс для каждой концентрации, последовательно помещая подачи труб в лаборатории флакон, содержащий следующий концентрация в серии и повторяйте, пока не будут применены все концентрации.
    Применение каждой концентрации может быть от 15 до 30 мин, но должны соответствовать каждой концентрации применяется и между экспериментов. Связанных с OT или VP-стимулирует схватки, как правило, требуют длительного применения (например, 25 мин) для учета сокращения в сокращение частоты наблюдается при стимуляции. Предварительные эксперименты для определения оптимального применения времени должны быть выполнены заранее с любого нового реагента тестируется.
  7. Возвращает входное отверстие PSS (с или без OT/VP) для размыва.
  8. Нажмите кнопку «Стоп» для прекращения записи. Немедленно сохраните данные в соответствующую папку и экспортировать версию в формате «.mat».

7. анализ данных

Примечание: Сбор данных и анализ может выполняться любое количество коммерчески доступных данных приобретение пакетов программного обеспечения. Смотрите Таблицу материалов для деталей программного обеспечения, используемые в настоящем Протоколе. Для точной оценки сократительной активности, параметры схватки измеряться включают: i) амплитуды сокращения, ii) частота сужением, iii) продолжительность спада, и iv) среднее усилие интеграл (рис. 4). Среднее усилие неотъемлемой является эквивалентом площадь под кривой сжатия и поэтому индекс общей работы, проделанной полосы ткани в данный момент времени. Некоторые или все параметры могут быть проанализированы. Как минимум рекомендуется, что означает неотъемлемой силу и амплитуды сокращения являются анализируемого53. В экспериментах, описанные здесь мы измерили изменения в амплитуде сужением и площадь под кривой.

  1. Импорт файла the.mat в программное обеспечение для анализа.
  2. Измените столбец, соответствующий для оси X, чтобы отразить экспериментальной время, принимая во внимание интервала частоты дискретизации. Эксперименты обычно записываются на 10 Гц, соответствует 10 образцов в секунду или 600 образцов/мин.
  3. Печать данных в виде X-Y координировать график с использованием «участок | Линия» функция.
  4. Нулевой базовый уровень сжатия, используя функцию «перевести вертикальной» на программное обеспечение.
  5. Выберите период соответствующего элемента управления.
    Примечание: Это период времени, предшествующий применение первого концентрации регент но равен продолжительности применения реагентов (рис. 4A). Например если применение препарата X 25 мин, используйте 25 мин, перед первым применением наркотиков X как элемент управления.
  6. Считывать по оси Y, записывать амплитуды (силы) сокращение на Макс пик каждой схватке, происходящих в период времени, выбранный и вычислить среднее значение.
  7. Измерить продолжительность сокращение на 50% это максимальный пик, читая от оси X в начале и конце каждой схватке и запишите среднее значение.
  8. Подсчитать количество сокращений, происходящих в сроки для создания значения для частоты.
  9. Используйте функцию «интеграция» для расчета AUC (в произвольных единицах, а.е.) для периода времени, выбранного.
    Примечание: В точном АУК, важно что базового плана схватки устанавливается в ноль на оси Y.
  10. Последовательно перемещаться по каждому из концентрации и записывать различные параметры сжатия.
  11. Набор данных элемента управления как 100% и Ускоренная значения, полученные при каждой концентрации реагентов в процентном отношении это т.е.управления, значения для стимуляции должно быть > 100% во время отдыха должно быть < 100%.
    Примечание: Нормализация данных таким образом должен позволять пользователю для сравнения результатов через полосы и фармакологических препаратов.
  12. Повторите для каждого эксперимента и передавать данные в графический пакет.

Результаты

С помощью этой модели, ответ на различные агонисты и антагонисты спада, а также Роман агентов, известных или неизвестных функции можно изучить и количественно. Стандартный фармакологические параметры, такие как значения50 IC и EC50 может быть рассчитана при реагентов используются в широком диапазоне концентраций, например, 10-5– 10-9 M и добавлены в повышении концентрации вдоль Логарифмическая шкала.

Эксперименты концентрация реакция антагонистов рецепторов окситоцина
В этом эксперименте, парных полоски человека миометрия были сократить как описано выше и показано на рисунке 1, смонтированные в ткани ванны, как показано на рисунке 2и возможность сбалансировать производить стабильный схватки равной амплитуды и частота. Полоски были затем подвергается эндогенного агонист OTR, OT (0,5 Нм) стимулировать схватки. После периода стабильной деятельности под OT (обычно 45 мин) атозибан был применен к одной полосы в повышении концентрации по логарифмической шкале (10-9– 10-6 М). Вторая полоса была оставлена в OT одиночку как время управления. Пример ответа на атозибан можно увидеть в рисунке 5А. Взяв схватки, непосредственно предшествующий первой концентрацию атозибан как управления (100%), амплитуда и AUC для каждой концентрации применяется рассчитывалась как показано на рисунке 4. Для управления времени экспериментов было измерено время эквивалент экспериментальных маневров. Данные затем были построены и кривых установлены, используя функцию нелинейной регрессии в пакет графических программ (Рисунок 5B-C). С точки зрения расчета тормозящий эффект, относительной силы атозибана было рассчитано путем измерения IC50 концентрации вызывает половину максимального (50%) ингибирующее ответ. То же самое может быть сделано для агонистов или стимуляторы спада. В этом случае потенции соединения рассчитывается от ЕС50 (концентрация, вызывая половину максимального стимулирующее ответ).

Расследования в ответ Роман соединений и тестирование их избирательность рецептор
Мы использовали это физиологически соответствующие модель ex vivo человека миометрия сокращений для изучения антагонистические эффекты заново синтезированные соединения, [D-Arg8]-inotocin ([D-Arg8] INT) на схватки стимулировали либо с родной V1а Агонист R, VP или родной агонист OTR, OT. Мы использовали этот assay для проверки рецептор избирательность [D-Arg8] INT, который ранее были определяется фармакологические методы, основанные на клетки быть антагонист на V1aR, но не на OTR54.

В этом эксперименте человека миометрия полосы были подвержены 0.5 Нм VP или 0.5 Нм OT примерно 1 h стимулировать схватки, как показано на рисунке 3, перед добавлением наш Роман соединение INT [D-Arg8] увеличение концентрации (рис. 6A и Рисунок 6 C). это было тогда по сравнению с коммерчески доступных, известный V1aR антагонист, SR49059 (Рисунок 6B). Рисунок 6A иллюстрирует зависимых уменьшается концентрация в VP-стимулирует человека миометрия схватки с увеличением концентрации [D-Arg8] INT. Данные для амплитуды сокращения и AUC для каждой концентрации резюмируются в рисунке 6Aii-iii. Эффект подобен показанному для увеличения концентрации ингибитора известных V1aR, SR49059, показано на рисунке 6Bi-iii. Избирательность [D-Arg8] INT к V1aR, но не в сторону OTR свидетельствует тот факт, что [D-Arg8] INT не не снижение человеческого миометрия схватки, которые стимулировали с OT (рис. 6 c) как амплитуда и AUC оставался стабильным (Рисунок 6Cii-iii).

Диаграмма матки с указанием слоев эндометрия; Рассеченный миометрий, децидуа в чашке Петри с чешуей.
Рисунок 1: биопсия диссекции человека миометрия. (A) A схема человека матки, показаны три ткани слои, которые составляют стенке матки. Внутренний слой эндометрия (Европейская в беременности, красная стрелка), средний слой является миометрия (мышечный слой, черная стрелка), который генерирует схватки, и внешний слой периметрии (или серозных мембраны, синяя стрелка) какие формы защитный слой вокруг матки. Области интереса для отбора проб биопсии изображен черный прямоугольник. Пример биопсии от беременной женщины во время кесарева сечения показано в пункте (B) с decidua и миометрия слои выделенный (serosa не видна). Важно, что слои различные ткани определены таким образом, чтобы правильно полоски миометрия разделяются для экспериментов. (C) показан пример полоса миометрия, который был расчлененный и обрезается. Как правило 2 – 6 полосы вырезать и закреплен как показано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Постановка эксперимента по сокращению миометрия; иллюстрация преобразователя; Теплообменное оборудование.
Рисунок 2: мульти орган Ванна экспериментальный набор вверх для измерения сокращений человека миометрия. (A) полоски миометрия, помещаются в небольшой (1 мл) орган Ванна камеры укладывают поверх подогревом водохранилище (i) и superfused раствором физиологического раствора (PSS) посредством перистальтического насоса (ii). Водохранилище поддерживается на заданной температуры путем циркулирующей водой ванну (iii). Каждая полоса прилагается к силу датчика (iv), которая регистрирует изменения напряженности во время сокращения. Это усиливается усилителем transbridge (v) и преобразуется в цифровой сигнал (vi), который записывается на компьютерной системы (vii), запущен связанный приобретение программного обеспечения. (B) Расширенное изображение камеры ванна органа с полосой человека миометрия в situ (красная стрелка), купались в PSS с одного конца придает силу датчика и другой фиксированной крюк. (C) Схематичный обзор настройки. Ткани камеры заполнены с PSS постоянно увлажненную с утепленным PSS при 37 ° C, которая осуществляется через теплообмена с подогревом воды водохранилища под ванны (сдержано на 45 ° C) и циркуляционный насос воды на 55 ° C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Экспериментальные графики сокращения мышц; действие окситоцина и вазопрессина; силово-временной анализ.
Рисунок 3: спонтанное и агонист стимулирует схватки человека миометрия в пробирке. В агонист свободных условиях, спонтанное схватки остаются стабильными для более чем 3 h записи без значительной потери амплитуды или области под--кривой (AUC)) (Aii, Aiii), демонстрирует надежность этой модели для расследования применение различных агентов на самопроизвольно спад. После установления стабильных, спонтанное схватки, 0.5 Нм окситоцина (B, OT) или вазопрессин (C, VP) был добавлен в решение физиологического раствора (PSS). Схватки под стимуляции также остаются стабильными за несколько часов без значительной потери амплитуды сокращения (ВП, ИСИ) или AUC (Biii, Ciii) включение эффекта различных сократительной агентов, чтобы быть расследование в присутствии агонисты миометрия. Данные представлены как среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). Обратите внимание, для агонист стимулирует схватки (B, C), контрольный период (100%) берется после первых 45 минут применения агониста, когда схватки стабилизировались. Во всех случаях полосы были superfused с PSS при 37 ° C, рН 7,4 (воспроизведены из Арроусмит и др. 40 с разрешения от Репродуктивного наук и Di Giglio et al. « 54 с разрешения от Научных докладов под лицензией Creative общего открытого доступа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

График измерения силы, анализ эффекта препарата, частота сокращений, реакция во времени.
Рисунок 4: анализ данных. (A) Соответствующий элемент управления период, показанный в красный был определен, выбрав сокращений, непосредственно предшествующий приложение тест соединения (наркотиков X). Этот период управления также равна времени применения наркотиков X (например, 40 мин в этом примере). После того, как измерять значения для периода управления устанавливаются как 100%. Затем все последующие измерения выражаются в процентах от элемента управления. (B) существует 4 различных параметров сжатия, которые могут быть измерены: (i) Амплитуда спада, который измеряет сокращение сил (силы, mN), (ii) частота спада, который измеряет скорость сжатия, (iii) продолжительность спада что измеряется на половину максимального пик спада, и (iv) площадь под кривой (также известный как неотъемлемой, произвольные подразделения), который дает мера общей работы, проделанной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

График дозозависимого влияния Атозибана на силу сокращения мышц; включает в себя диаграмму анализа IC50.
Рисунок 5: запись антагонистический эффект атозибан на окситоцина индуцированной схватки в человека миометрия. После того, как спонтанное схватки были созданы, схватки были стимулируется с агонистом рецепторов окситоцина, окситоцина (OT). Схватки были позволены стабилизации при стимуляции для дальнейшего 45 мин (A) V1a и OT антагонист рецепторов, атозибан затем была применена в повышении концентрации по логарифмической шкале (10-9-10-5М). Схватки в период, предшествующий первой концентрация атозибан были измерены и в качестве контроля (100%). Деятельность при каждом последующем концентрации был измеряется и выражается в процентах от элемента управления. То же была выполнена для полосы, подвергается OT, только используя время эквивалент экспериментальной маневров. Данные были нанесены в графического программного обеспечения: (B, C) показывают концентрация реакция кривых для антагонистического эффекта атозибан (синий) и соответствующих разрежения транспортного средства (серый, время управления) по амплитуде сужением OT-индуцированной миометрия и Площадь под кривой (AUC)), соответственно. Данные представлены как среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего (SEM) процент амплитуды и AUC деятельности управления (перед применением атозибан). Затем были рассчитаны значения IC50 , которые дают на котором половина максимальной тормозной (50%) ответ для амплитуды сокращения и интеграл силы (AUC)) является концентрация достигается (воспроизведены из Арроусмит et al. 40 с разрешения от Репродуктивного наук). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Электрофизиологические графики с гистограммами; измерение силы; D-Arg; соединения VP и SR; Реакция на дозу.
Рисунок 6: тестирование эффект и рецептор избирательность соединения на человека миометрия сужением роман. После того, как были созданы спонтанное схватки человека миометрия, схватки были стимулируется с агонистом рецепторов вазопрессина, вазопрессин (VP) (Ai, Bi) или агонистом рецепторов окситоцина, окситоцина (OT) (Ci). Эффект [D-Arg8]-inotocin ([D-Arg8] INT) и коммерчески доступных антагонист1aR V, SR49059 на схватки стимулируется VP оценивалась путем применения увеличение концентрации соединений. Типичные ответы приведены в (Ai, Bi). Связанные анализировали данные по амплитуде и площадь под кривой (AUC) приведены в (ii) и (iii), соответственно где эффект была выражена в процентах от элемента управления деятельностью (100%). [D-Arg8] INT и известных антагонист1aR V, SR49059 вызвало доза зависимых уменьшение амплитуды и АУК, поддерживая роль [D-Arg8] INT как антагонист рецепторов1aR V в человека миометрия. В отличие от INT [D-Arg8] не затрагивают схватки, стимулируется OT (Ci-iii), следовательно аналогично наши выводы из клеток на основе, [D-Arg8] INT также показывает селективности к V1aR в человека миометрия (данные приводятся с ди Giglio и др. « 54 с разрешения от Научных докладов под лицензией Creative общего открытого доступа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Хотя большинство разработки лекарственных средств предназначен для лечения заболеваний человека, наиболее фундаментальные исследования главным образом осуществляется в животных тканях. Здесь мы описываем методы расследования ex vivo сокращений человека миометрия, полученные от операции, которые могут быть использованы для решения ряда важных вопросов связанных с матки физиологии и патологии, а также для проверки функциональных реакций для известных и новых фармакологических агентов для разработки лекарственных препаратов. В частности мы подчеркиваем использования этот assay расследовать антагонистических ответ известный OTR и V1aR конкурентным антагонистом, атозибан на OT-индуцированной беременных миометрия схватки, а также определять ответ и рецептор избирательность недавно разработанных селективный антагонист1aR V, [D-Arg8] INT. Мы демонстрируем, что важные фармакокинетические параметры, такие как ЕС50 и IC50 может быть рассчитана, которые привести в соответствие с данными на основе ячеек фармакологии.

Одновременное использование нескольких полос позволяет для прямого сравнения нескольких агента эффекты, конкуренции эксперименты с антагонистами и надлежащего времени и транспортного средства контроля. Как часто полоски готовы в группах по 2, 4 или 8, эта технология обеспечивает умеренный пропускную способность, позволяя тестирование соединения 2-4 на 6 – 8 (нарастающим итогом) концентрации (за биопсия). Этот метод также предоставляет данные в реальном времени, так что можно быстро оценить последствия и протоколы могут быть скорректированы. Кроме того этот метод может использоваться для проверки любых химических соединениях интерес и успешно используется ряд исследовательских групп сосредоточена на физиологии миометрия и в лекарственных препаратах. Помимо анализа чистых соединений, как описано в этом документе, модель сократительной способности матки был также и может быть успешно использован для экрана для Роман утеротоника соединений из смеси, такие как лекарственные препараты от традиционной медицины7 , 55 , 56.

Хотя эта модель является технически надежной и показывает хорошую воспроизводимость, она имеет некоторые ограничения: рассечение может быть трудным для тех, кто незнаком с ткани или с использованием оборудования рассечение, следовательно новым пользователям потребуется некоторое время для оптимизации ткани подготовка и протоколы. Следует также отметить, что этого человека миометрия значительно отличается по внешнему виду другие модели, такие как крысы и мыши. Большинство грызунов матки состоят из двух ламповую маточные рожки, каждый в комплекте с яичника на одном конце и вступил на шейке матки. Каждый Рог четко определены продольных и круговой мышцы слоев, которые могут быть легко разделены на вскрытие хотя волокна разных типов в человека миометрия часто взаимосвязаны, формируя сетку». Кроме того сокращение профили человека миометрия очень отличается от грызунов. Прежде всего сужения в человека миометрия реже, но больше в продолжительности. Экспериментальный сроки для работы с человека миометрия, поэтому часто гораздо дольше, чем грызунов модели. Различия в экспрессии рецепторов между видами может также способствовать весьма заметные различия в ответах агонисты и это следует иметь в виду, если экстраполировать результаты различных видов.

Есть также количество шагов, которые необходимо рассмотреть для максимального выхода из этой системы. Важнейшие шаги включают в себя сохранение жизнеспособности тканей как забота при обработке тканей, чтобы избежать любого ненужного ущерба во время вскрытия или при монтаже. Опытный глаз обязан вскрыть тонкой полоски мышцы матки, гарантируя ориентации мышечных волокон в продольном направлении и после плоскости ткани, а также избегая рубцовой ткани, Европейская и малых судов. Для облегчения ориентации целей после образца в лаборатории, можно добавить тег (например, небольшие хирургические строчка) во время сбора в одну сторону биопсии разграничить серозных края от децидуальной края.

Ткани должны храниться в устойчивый 36-37 ° C во время экспериментов, как функции тканей наблюдаются перепады температуры. Это может быть достигнуто с надежной кондиционера в лаборатории. Постоянное перфузии утепленные PSS гарантирует, что температура поддерживается а также смыва из отходов от сжатия. Температура в пределах органа ванны может быть изменено путем изменения скорости потока или корректировка ванны температура воды непосредственно. Размер ванночка, по сравнению с традиционными 5-50 мл бани обеспечивает относительно быстрый оборот PSS и размыва реагентов. Миниатюрный орган баня как описано здесь, также уменьшает объем PSS и реагенты интереса необходимо, таким образом минимизируя затраты и избавления драгоценных, недавно разработанных химических веществ. Кроме того благодаря ванночка размер и с помощью буфера на основе HEPES, эта система не требует оксигенации например, восходящей PSS с Карбоген. Важно также стандартизация напряженности, применяется к полоски. Для прокладки размеров (5 x 2 x 1 мм) это должно быть около 2 млн (эквивалент ~0.2 g). Альтернативные методы включают применение решения высоким содержанием калия побудить максимального сжатия и растяжения до половины этого максимального сокращения. Однако следует отметить, что напряженность применяется в естественных условиях могут отличаться.

Основные задачи включают в себя получение тканей от человеческих субъектов, но хотя налогообложение, тканях человека явно представляют собой наиболее физиологически соответствующие (и полезным) модель для изучения сокращения матки в человеческих болезней и наркотиков discovery. Изолированные ткани, которую полоски однако, не обязательно означает ткани в естественных условиях как они освобождаются, например, от гормональной и нервной ввода, который, хотя и не существенно для сжатия, будут модулировать схватки в естественных условиях. Однако этот assay предоставляет возможность анализа сокращения миометрия контролируемым образом, отделены от таких воздействий. Она также позволяет для влияния таких факторов, как гормональный контроль сжатия (например, через OT, вице-президент, простагландинов и т.д.) должны расследоваться, предоставляя ключи для регулирования функции миометрия. Как тканей получаются из разных женщин, естественно есть некоторые различия в спонтанной сократительной профилей между образцами. Поэтому часто бывает необходимо проводить эксперименты на большом количестве (~ n = 10) образцов, чтобы свести к минимуму различия в некоторых наборах данных53. Это особенно важно при сравнении сократительной активности между различными группами пациентов. Нормализующее ответ агонисты и антагонисты контролировать деятельность (т.е., выражая как процент от деятельности управления или высокий K+) уменьшает некоторые из этой вариации. Кроме того чтобы уменьшить различия между газа, данные могут быть нормированы Стрип площади поперечного сечения путем измерения их длина и вес пост экспериментов41. Это особенно полезно при сравнении сокращение шаблонов между различными группами пациентов.

Ограничения этой техники также включают доступ к свежие ткани, которая требует хорошие рабочие отношения с сотрудниками больницы, особенно театр сотрудников и тех, кто участвует в процессе согласия. Этические разрешения от местных Комитет по этике исследований и Институт или больницу Наблюдательный Совет также должны быть на месте. Коллекции человека миометрия чаще всего выполняется во время родов CS, когда донор претерпевает хирургии. Биопсия берется из того же сайта разреза матки, сделал для доставки ребенка и поэтому пациент не нужно проходить любые дальнейшие дополнительные процедуры. Сотрудники театра и хирурга выполнения биопсии должны быть осведомлены о последующего использования тканей, и что они не должны быть помещены в фиксирующие решения таких как для отправки в отделение патологии. Долго экспериментальной намечено еще одно соображение. Эксперименты с тканями человека занять много часов (обычно > 6 ч) (в отличие от 2-3 ч для аналогичный эксперимент в мыши или крысы матки), ввиду медленнее частота сужением и 2-3 h лаг времени между ткани монтаж и создание спонтанной схватки. Однако, как мы показали, схватки тканей человека являются надежными и когда могут контракта для многих часов без значительных усталость40.

Эта система также позволяет преодолевать включая возможность проверить фармацевтических реагентов на беременных ткани другие трудности в естественных условиях работы. Этот метод можно легко экстраполировать на другие виды, включая мышь, whereby первые результаты могут быть подтверждены прежде чем далее в целом животных исследования. Контролируемые изменения температуры, состава superfusate (PSS) и рН можно сделать легко имитировать различные сценарии в естественных условиях и проанализировать влияние этих изменений на составные поведение. Основные принципы измерения изометрическое напряжение в миометрия полос также может быть расширен для одновременного изменения внутриклеточной концентрации кальция или рН измерения с использованием флуоресцентных Ca или показателей рН (H+) и оборудования для обнаружения и запись флуоресценции57,,5859,60.

В целом, человека миометрия представляет собой надежный и физиологически соответствующие модель характеризуют и проверить роман терапевтических соединений в лекарственных препаратах — чистого соединения и смеси. Мы предоставили примеры его использования в лекарственных препаратах по системе OT/VP и сосредоточены на OTR и V1R антагонисты, чтобы показать, как эта модель может использоваться для определения составных эффективность и потенции на определенные цели и проверки лигандом избирательности. Однако это следует иметь в виду, что этот метод может использоваться для изучения любой цели интерес или путь, ведущий к сокращения миометрия (или релаксации), а также помощи лекарств новых целей и путей и углублению нашего понимания миометрия физиологии и патофизиологии.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Австрийский фонд науки (FWF) в рамках проекта I3243 и Совет европейских исследований (ERC) под Европейского союза Horizon 2020 программы научных исследований и инноваций (грантовое соглашение No 714366). РГС поддержала Австралийский исследовательский совет (ARC) будущее стипендий (FT140100730) и мм дуга обнаружения ранней карьеры исследователь (ПОЛУПРОЗРАЧНЫЕ) стипендий (DE150100784). SA поддерживается Харрис-благополучие преждевременных рождения исследовательский центр Грант в ведении благополучия женщин, Великобритания.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Программное обеспечение OriginВерсия Origin Lab2015
Программное обеспечение LabscribeФормально Datatrax
GraphPad Prism Графическое программное обеспечениеGraphPad PrismPRISM 5
LabTrax 4-канальный сбор данныхWPILAB-TRAX-4
Transbridge Преобразователь УсилительWPISYS-TBM4M
Преобразователь силы перемещенияWPIFORT10g10 г
BNC в BNC КабельWPI500184
Магнитный зажимСтенд WPIM10
МикрометрВосстановленный из микроскопов
Перистальтический насосGilsonMINIPULS3R4 Стандартный насос с головкой насоса
Всасывающие насосыРазличныевоздушные насосы AP2
Циркуляционная водяная баняGrant InstrumentsTC1205 л
Перспекс Тканевая ваннаИзготовленный на заказ
Резервуар для водыдействительно полезная коробка7 л
Крючки для салфеток (фиксированные)Ручная работа в доме
Перистальтическая трубкаGilsonF117948ПВХ внутренний диаметр
Tygon TubingFisher Scientificразличных диаметровR-3603
Алюминиевые зажимыЛазерные услуги, СШАИзготовленный
Стерео Zoom Бинокулярный микроскопWPIPZMIV
Волоконно-оптический источник светаWPIPHOTONIC PL 2000
Препарирующая посударучной работы с Sylgard
Sylgard Набор силиконовых эластомеровDow CorningSylgard 170 Kit
Vannas НожницыWPI500868,5 см, прямой край
Ирисовые щипцыWPI1591410 см, прямой край (зубчатый)
Препарирующие ножницыWPI1439310 см, прямые
Препарирующие штифтыSIGMAZ192341B-D прецизионный направляющий шприц игла 30G
HBSSSIGMAH9269
Физиологический раствор солиSIGMAразличныесоли PSS
Окситоцина ацетатаSIGMAO6379
[Arg8]-вазопрессина ацетатная сольSIGMAV9879
2,79 ммна заказ

Ссылки

  1. Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  2. Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398 (1), 227-238 (2010).
  3. Wray, S. Insights into the uterus. Exp Physiol. 92 (4), 621-631 (2007).
  4. Wray, S., Kupittayanant, S., Shmygol, A., Smith, R. D., Burdyga, T. The physiological basis of uterine contractility: a short review. Exp Physiol. 86 (2), 239-246 (2001).
  5. Matthew, A., Shmygol, A., Wray, S. Ca2+ entry, efflux and release in smooth muscle. Biol Res. 37 (4), 617-624 (2004).
  6. Wray, S., et al. Calcium signaling and uterine contractility. J Soc Gynecol Investig. 10 (5), 252-264 (2003).
  7. Gruber, C. W., O'Brien, M. Uterotonic plants and their bioactive constituents. Planta medica. 77 (3), 207-220 (2011).
  8. Maul, H., Maner, W. L., Olson, G., Saade, G. R., Garfield, R. E. Non-invasive transabdominal uterine electromyography correlates with the strength of intrauterine pressure and is predictive of labor and delivery. J Matern Fetal Neonatal Med. 15 (5), 297-301 (2004).
  9. Newman, R. B. Uterine contraction assessment. Obstet Gynecol Clin North Am. 32 (3), 341-367 (2005).
  10. Haran, G., Elbaz, M., Fejgin, M. D., Biron-Shental, T. A comparison of surface acquired uterine electromyography and intrauterine pressure catheter to assess uterine activity. Am J Obstet Gynecol. 206 (5), 412-e415 (2012).
  11. Condon, J., et al. Telomerase immortalization of human myometrial cells. Biol Reprod. 67 (2), 506-514 (2002).
  12. Soloff, M. S., et al. Immortalization and characterization of human myometrial cells from term-pregnant patients using a telomerase expression vector. Mol Hum Reprod. 10 (9), 685-695 (2004).
  13. Buxton, I. L., Vittori, J. C. Cholesterol depletion enhances both spontaneous and agonist-evoked uterine smooth muscle contractions in a reversible manner. Proc West Pharmacol Soc. 48, 126-128 (2005).
  14. Matthew, A., Kupittayanant, S., Burdyga, T., Wray, S. Characterization of contractile activity and intracellular Ca2+ signalling in mouse myometrium. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 11 (4), 207-212 (2004).
  15. Heaton, R. C., Taggart, M. J., Wray, S. The effects of intracellular and extracellular alkalinization on contractions of the isolated rat uterus. Pflugers Arch. 422 (1), 24-30 (1992).
  16. Hutchings, G., Deprest, J., Nilius, B., Roskams, T., De Ridder, D. The effect of imatinib mesylate on the contractility of isolated rabbit myometrial strips. Gynecol Obstet Invest. 62 (2), 79-83 (2006).
  17. Wilson, R. J., Allen, M. J., Nandi, M., Giles, H., Thornton, S. Spontaneous contractions of myometrium from humans, non-human primate and rodents are sensitive to selective oxytocin receptor antagonism in vitro. BJOG. 108 (9), 960-966 (2001).
  18. Choudhury, S., Garg, S. K., Singh, T. U., Mishra, S. K. Functional and molecular characterization of maxi K+ -channels (BK(Ca)) in buffalo myometrium. Anim Reprod Sci. 126 (3-4), 173-178 (2011).
  19. Smith, R. C., McClure, M. C., Smith, M. A., Abel, P. W., Bradley, M. E. The role of voltage-gated potassium channels in the regulation of mouse uterine contractility. Reprod Biol Endocrinol. 5, 41(2007).
  20. Jones, K., Shmygol, A., Kupittayanant, S., Wray, S. Electrophysiological characterization and functional importance of calcium-activated chloride channel in rat uterine myocytes. Pflugers Arch. 448 (1), 36-43 (2004).
  21. Popescu, L. M., et al. Imatinib inhibits spontaneous rhythmic contractions of human uterus and intestine. Eur J Pharmacol. 546 (1-3), 177-181 (2006).
  22. Taggart, M. J., Wray, S. Contribution of sarcoplasmic reticular calcium to smooth muscle contractile activation: gestational dependence in isolated rat uterus. J Physiol. 511 (Pt 1), 133-144 (1998).
  23. McCallum, L. A., Pierce, S. L., England, S. K., Greenwood, I. A., Tribe, R. M. The contribution of Kv7 channels to pregnant mouse and human myometrial contractility. J Cell Mol Med. 15 (3), 577-586 (2011).
  24. Bernstein, K., et al. Calcium-activated chloride channels anoctamin 1 and 2 promote murine uterine smooth muscle contractility. Am J Obstet Gynecol. , (2014).
  25. Khan, R. N., Morrison, J. J., Smith, S. K., Ashford, M. L. Activation of large-conductance potassium channels in pregnant human myometrium by pinacidil. Am J Obstet Gynecol. 178 (5), 1027-1034 (1998).
  26. Phillippe, M., Basa, A. Effects of sodium and calcium channel blockade on cytosolic calcium oscillations and phasic contractions of myometrial tissue. J Soc Gynecol Investig. 4 (2), 72-77 (1997).
  27. Ausina, P., et al. Effect of inhibition of the electrogenic Na+/K+ pump on the mechanical activity in the rat uterus. Fundam Clin Pharmacol. 10 (1), 38-46 (1996).
  28. Melin, P., Trojnar, J., Johansson, B., Vilhardt, H., Akerlund, M. Synthetic antagonists of the myometrial response to vasopressin and oxytocin. J Endocrinol. 111 (1), 125-131 (1986).
  29. Hahn, D. W., et al. Evaluation of 1-deamino-[D-Tyr(Oethyl)2, Thr4, Orn8] vasotocin, an oxytocin antagonist, in animal models of uterine contractility and preterm labor: a new tocolytic agent. Am J Obstet Gynecol. 157 (4 Pt 1), 977-982 (1987).
  30. Demarest, K. T., et al. Profile of an oxytocin antagonist, RWJ 22164 for treatment of preterm labor in laboratory models of uterine contractility. American journal of perinatology. 6 (2), 200-204 (1989).
  31. Goodwin, T. M., et al. The pharmacokinetics of the oxytocin antagonist atosiban in pregnant women with preterm uterine contractions. Am J Obstet Gynecol. 173 (3 Pt 1), 913-917 (1995).
  32. Goodwin, T. M., et al. The effect of the oxytocin antagonist atosiban on preterm uterine activity in the human. Am J Obstet Gynecol. 170 (2), 474-478 (1994).
  33. Goodwin, T. M., et al. Treatment of preterm labor with the oxytocin antagonist atosiban. American journal of perinatology. 13 (3), 143-146 (1996).
  34. Romero, R., et al. An oxytocin receptor antagonist (atosiban) in the treatment of preterm labor: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial with tocolytic rescue. Am J Obstet Gynecol. 182 (5), 1173-1183 (2000).
  35. Norstrom, A., Andersson, A., Vilhardt, H. Contractile effect of oxytocin and 1-deamino-1-carba-2-tyrosine (0-methyl)-oxytocin in myometrial tissue from non-pregnant and term pregnant women. Acta Endocrinol (Copenh). 122 (5), 566-568 (1990).
  36. Atke, A., Vilhardt, H. Uterotonic activity and myometrial receptor affinity of 1-deamino-1-carba-2-tyrosine(O-methyl)-oxytocin. Acta Endocrinol (Copenh). 115 (1), 155-160 (1987).
  37. Hunter, D. J., Schulz, P., Wassenaar, W. Effect of carbetocin, a long-acting oxytocin analog on the postpartum uterus. Clin Pharmacol Ther. 52 (1), 60-67 (1992).
  38. Moraitis, A. A., Cordeaux, Y., Charnock-Jones, D. S., Smith, G. C. The Effect of an Oxytocin Receptor Antagonist (Retosiban, GSK221149A) on the Response of Human Myometrial Explants to Prolonged Mechanical Stretch. Endocrinology. 156 (10), 3511-3516 (2015).
  39. Al-Qahtani, S., et al. Diabetes is associated with impairment of uterine contractility and high Caesarean section rate. Diabetologia. 55 (2), 489-498 (2012).
  40. Arrowsmith, S., Neilson, J., Bricker, L., Wray, S. Differing In Vitro Potencies of Tocolytics and Progesterone in Myometrium From Singleton and Twin Pregnancies. Reprod Sci. 23 (1), 98-111 (2016).
  41. Arrowsmith, S., Quenby, S., Weeks, A., Burdyga, T., Wray, S. Poor spontaneous and oxytocin-stimulated contractility in human myometrium from postdates pregnancies. PloS one. 7 (5), e36787(2012).
  42. Arrowsmith, S., Robinson, H., Noble, K., Wray, S. What do we know about what happens to myometrial function as women age? J Muscle Res Cell Motil. 33 (3-4), 209-217 (2012).
  43. Quenby, S., Matthew, A., Zhang, J., Dawood, F., Wray, S. In vitro myometrial contractility reflects indication for caesarean section. BJOG. 118 (12), 1499-1506 (2011).
  44. Turton, P., et al. A comparison of the contractile properties of myometrium from singleton and twin pregnancies. PloS one. 8 (5), e63800(2013).
  45. Zhang, J., Bricker, L., Wray, S., Quenby, S. Poor uterine contractility in obese women. BJOG. 114 (3), 343-348 (2007).
  46. Higgins, C. A., et al. Maternal obesity and its relationship with spontaneous and oxytocin-induced contractility of human myometrium in vitro. Reprod Sci. 17 (2), 177-185 (2010).
  47. Crankshaw, D. J., O'Brien, Y. M., Crosby, D. A., Morrison, J. J. Maternal body mass index and spontaneous contractility of human myometrium in pregnancy. J Perinatol. 37 (5), 492-497 (2017).
  48. Luckas, M. J., Wray, S. A comparison of the contractile properties of human myometrium obtained from the upper and lower uterine segments. BJOG. 107 (10), 1309-1311 (2000).
  49. Chapman, N. R., Kennelly, M. M., Harper, K. A., Europe-Finner, G. N., Robson, S. C. Examining the spatio-temporal expression of mRNA encoding the membrane-bound progesterone receptor-alpha isoform in human cervix and myometrium during pregnancy and labour. Mol Hum Reprod. 12 (1), 19-24 (2006).
  50. Robson, S. C., Simpson, H., Ball, E., Lyall, F., Bulmer, J. N. Punch biopsy of the human placental bed. Am J Obstet Gynecol. 187 (5), 1349-1355 (2002).
  51. Popat, A., Crankshaw, D. J. Variable responses to prostaglandin E(2) in human non-pregnant myometrium. Eur J Pharmacol. 416 (1-2), 145-152 (2001).
  52. Arrowsmith, S., Neilson, J., Wray, S. The combination tocolytic effect of magnesium sulfate and an oxytocin receptor antagonist in myometrium from singleton and twin pregnancies. Am J Obstet Gynecol. 215 (6), 789-e789 (2016).
  53. Crankshaw, D. J., Morrison, J. J. Methodology and pharmacological analysis of effects of uterotonic compounds in human myometrium in vitro. Am J Obstet Gynecol. 205 (2), 155-e156 (2011).
  54. Di Giglio, M. G., et al. Development of a human vasopressin V1a-receptor antagonist from an evolutionary-related insect neuropeptide. Sci Rep. 7, 41002(2017).
  55. Attah, A. F., et al. Ethnobotanical survey of Rinorea dentata (Violaceae) used in South-Western Nigerian ethnomedicine and detection of cyclotides. J Ethnopharmacol. 179, 83-91 (2016).
  56. Koehbach, J., et al. Oxytocic plant cyclotides as templates for peptide G protein-coupled receptor ligand design. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21183-21188 (2013).
  57. Taggart, M. J., Burdyga, T., Heaton, R., Wray, S. Stimulus-dependent modulation of smooth muscle intracellular calcium and force by altered intracellular pH. Pflugers Arch. 432 (5), 803-811 (1996).
  58. Luckas, M. J., Taggart, M. J., Wray, S. Intracellular calcium stores and agonist-induced contractions in isolated human myometrium. Am J Obstet Gynecol. 181 (2), 468-476 (1999).
  59. Parratt, J. R., Taggart, M. J., Wray, S. Functional effects of intracellular pH alteration in the human uterus: simultaneous measurements of pH and force. J Reprod Fertil. 105 (1), 71-75 (1995).
  60. Taggart, M., Wray, S. Simultaneous measurement of intracellular pH and contraction in uterine smooth muscle. Pflugers Arch. 423 (5-6), 527-529 (1993).

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Сократительная способность миометрияанализ ex vivoдатчик силыорганная ваннарецептор окситоцинарецептор вазопрессинаатозибанSR49059диссекция тканей
Сократительную способность измерения человеческого гладких мышц матки для разработки лекарственных средств помощи
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.