Этот протокол описывает метод для достижения стабильной интеграции гена интереса в геноме человека транскрипционно регулируемой системой Спящая красавица . Как сообщается, подготовка интеграции дефектных лентивирусные векторы, трансдукция в пробирке клеток человека и молекулярного анализа на transduced клетки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Эффективным в Vitro транспонирования метод транскрипционно регулируемых Спящая красоты системой упакованы в дефектных лентивирусные вектор интеграции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Спящая красавица (SB) transposon система-вирусных интеграции с доказанной эффективностью для переноса генов и функциональной геномики. Для оптимизации механизма transposon SB, заняты транскрипционно регулируемых гиперактивный Транспозаза (SB100X) и на основе T2 transposon. Как правило Транспозаза и transposon плазмиды transfection временно предоставляются и SB100X выражение определяется учредительными промоутер. Здесь мы описываем эффективный метод для доставки компонентов SB для клеток человека, которые устойчивы к несколько методов трансфекции физические и химические, контролировать выражение SB100X и стабильно интегрировать ген интереса (ГОИ) через «вырезать и вставить» SB механизма. Выражение гиперактивный Транспозаза жестко контролируется системой тет-ON, широко используется для управления экспрессии генов с 1992 года. Гена интереса в окружении Перевернутый повторяется (IR) T2 transposon. Оба компонента SB упакованы в интеграции дефектных лентивирусные векторы временно производится в HEK293T клетках. Клетки человека, линии клетки или клетки первичной из тканей человека, находятся в vitro временно преобразованы с вирусных векторов. После добавления доксициклин (dox, тетрациклин аналоговый) в питательной среды доработки Транспозаза выражение измеряется и приводит длинный длительный интеграции гена интереса в геноме клеток лечение. Этот метод является эффективным и применимым к клеточной линии (например, клетки HeLa) и главные ячейки (например, человека первичной кератиноцитов) и таким образом представляет собой ценный инструмент для генной инженерии и передача терапевтических генов.
Введение
Гиперактивный SB100X Транспозаза, в сочетании с transposon на основе T2 уже используется в доклинических гена терапии приложения1,2,3, геном модификации4,5, и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) перепрограммирования6,7. Как правило компоненты SB временно предоставляемые плазмида transfection и сильный промоутер учредительный диски выражение Транспозаза. Однако несмотря на улучшение новых методов трансфекции, поставка системы 2 компонентных ос....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. плазмид занятых
Примечание: Плазмида НКПС PGKrtTA2S-м2 был любезно предоставляемый профессор Zappavigna (Университет Модены и Реджо-Эмилии, Модена, Италия). PCMVSB100X плазмиды, перевозящих кодирующая последовательность гиперактивный Транспозаза и transposon плазмиды pT2/BH были любезно предоставленных профессор з. Ivics (Институт Пауля Эрлиха, Ланген, Германия) и профессор з. Izvak (центр Макса Дельбрюка молекулярной медицины, Берлин, Германия).
- Для всех форм клонирования в Escherichia Coli (E. coli), следуйте клонирования стратегия выбора и энзима ограничения процедуры или амплификации PCR фрагмен....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
С помощью процедуры представлены здесь, три IDLV векторы нося SB компоненты (SB100X, rtTA2S-transposon м2 и T2-GFP) были упакованы и используется для эффективной доставки и плотно регулировать систему SB в клетках человека. На рисунке 1A показана схема для в vitro трансдукции клеток HeLa, который был проведен для оценки регуляцию SB Транспозаза с лучшими дозы комбинации двух векторов IDLV (сообщается в таблице 2). Регуляци.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описываем широко доступной методологии стабильно интегрировать ГОЙ в геном клетки-мишени, Спящая красавица-опосредованной транспонирования. Хотя для обеспечения синцитиального метод для изменения генома была разработана система SB, эффективности механизма интеграции (Транспозаза и T2 transposon) является обязательным. Таким образом для использования системы SB на вряд ли transfectable Главные ячейки, вирусный доставки компонентов SB проводилась в последние годы10,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Мы благодарим Zappavigna профессор, Университет Модены и Реджо-Эмилии, Модена, Италия для предоставления нам НКПС PGKrtTA2S-плазмида м2. Мы также признаем профессор з. Ivics (Институт Пауля Ehlrich, Ланген, Германия) и профессор з. Izvak (центр Макса Дельбрюка молекулярной медицины, Берлин, Германия) для pCMVSB100X и pT2/BH плазмид. Эта работа была поддержана Дебра международного и итальянского министерства университетов и исследований.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Дульбекко s модифицированный Eagle' Среда с глюкозой 4,5 г/л без L-глутамина | Lonza | BE12-614F | Клеточная культуральная среда. |
| Сыворотка HyClone Fetal Bovine Serum (США), характерная | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.03 | Сыворотка, используемая HEK293T культуре клеток для производства лентивирусных частиц. |
| Пенициллин 10.000 ЕД/мл Стрептомицин 10.000 ЕД/мл | Лонза | ДЭ17-602Е | Реагенты для среды клеточных культур. |
| L-Glutamine 200mM | Реагент Lonza | BE17-605E | для среды для культивирования клеток. |
| Реагент хлорид натрия (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | для приготовления HBS 2X. |
| HEPES Buffer, 1M Stock in normal salt | Lonza | BE17-737E | Реагент для приготовления HBS 2X. |
| Дигидрат гидрофосфата натрия (Na2HPO4· 2H2O), 99,5% | Merck | 106580 | Реагент для приготовления HBS 2X. |
| Соляная кислота - реагент ACS 37% (HCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | Реагент для приготовления HBS 2X. |
| Стерильная вода для инъекций | Fresenius | Kabi-Реагент | для препарата HBS 2X. |
| 0,45 & микро; m PESS фильтр | Ватман | 10462100 | Фильтры, используемые для удаления клеточного мусора из вирусной надосадочной жидкости. |
| Полиалломеровские пробирки Beckman | Coulter | 326823 | Tubes для концентрирования векторов IDLV методом ультрацентрифугирования. |
| PBS-1X без Ca, Mg | Lonza | BE17-516F | Буфер для промывки клеток и ресуспензии лентивирусных частиц. |
| Бычий сывороточный альбумин (БСА) | Sigma-Aldrich | A2153 | (Опционально) Буфер для ресуспензии лентивирусных частиц. |
| Набор для иммунозахвата ВИЧ-1 Gag p24 | Perkin Elmer | NEK50001KT | Набор для титрования частиц IDLV. |
| Полибрен | Сигма-Олдрич | 107689 | реагент для повышения эффективности трансдукции. |
| Трипсин (10X) 2,5% в HBSS без Ca, Mg | GIBCO | BE17-160E | реагент для отделения клеток HeLa (стоковый раствор, разбавляется). |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота динатриевая соль (ЭДТА) | 100938B | AnalaR BDH | Реагент для приготовления рабочего раствора трипсина. |
| 0,5% Трипсин-ЭДТА, без фенола красного (10X) | GIBCO | 15400-054 | Реагент для отделения кератиноцитов (исходный раствор, разбавляется). |
| Донорская бычья сыворотка, новозеландского происхождения | GIBCO | 16030-074 | Сыворотка для швейцарской мышиной клеточной культуры 3T3-J2 (питательный слой). |
| Ветчина s F12 media | GIBCO | 21765 | Среда для кератиноцитов. |
| Фетальная бычья сыворотка | Lonza | DE14-801F | Сыворотка для среды культивирования клеток HeLa. |
| Фетальная бычья сыворотка, сертифицированная, Австралия Происхождение | GIBCO | 10099-141 | Сыворотка для среды первичной культуры кератиноцитов человека. |
| Инсулин из поджелудочной железы крупного рогатого скота | Sigma-Aldrich | I5500 | Реагенты для роста кератиноцитов. |
| Аденин | VWR | 1152-25 | Реагенты для роста кератиноцитов. |
| Гидрокортизон | VWR | 3867-1 | Реагенты для роста кератиноцитов. |
| Холерный токсин из Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Реагенты для роста кератиноцитов. |
| Трийодтиронин | Сигма-Олдрич | T5516 | Реагенты для роста кератиноцитов. |
| Реагенты для роста кератиноцитов | Human EGF | Austral Biological | GF-010-9 |
| Мышиное моноклональное APC-конъюгированное антитело Anti-Feeder | Miltenyi Biotech | 130-096-099 | Для мечения питающего слоя. |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | Набор для очистки РНК. |
| SuperScript III Обратная транскриптаза | Life Technologies | 18080051 | набор обратной транскриптазы. |
| Дезоксинуклеотидная смесь, 10 мМ (dNTP) | Sigma-Aldrich | D7295 | Реагент для полуколичественной ПЦР. |
| (любой) | ДНКазы/РНКазы | для полуколичественной ПЦР и для количественной ОТ-ПЦР. | |
| GoTaq G2 Полимераза горячего старта | Promega | M740B | Taq полимераза. |
| Агароза, для молекулярной биологии | Sigma-Aldrich | A9539 | Реагент для электрофореза в агарозном геле. |
| UltraPure TBE Buffer, 10X | Invitrogen | 15581028 | Реагент для электрофореза в агарозном геле, разбавляемый (1X) в ddH2O. |
| Бромид этидия | Sigma-Aldrich | E1510 | Реагент для электрофореза в агарозном геле. |
| Доксициклин | Сигма-Олдрич | D-9891 | препарат для индуцирования экспрессии транспозазы в клетках HeLa и в кератиноцитах |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystem | 4304437 | TaqMan Universal PCR Master Mix включая праймеры и зонд. |
| Пробирка для центрифуги из полипропилена высокой прозрачности объемом 15 мл, коническое дно, с завинчивающейся крышкой с куполообразным уплотнением, стерильные | Falcon Corning | 352096 | для сбора клеток и подготовки векторного разведения. |
| 150 мм TC-обработанная чашка для клеточных культур с сеткой 20 мм, стерильная | чашка для клеточных культур Falcon Corning | 353025 | чашка для клеточных культур для вирусного производства. |
| 6 Хорошо прозрачная многолуночная клеточная культуральная пластина с плоским дном, обработанная TC, с крышкой, индивидуально упакованная, стерильная | Falcon Corning | 353046 | клеточной культуры для HeLa и первичной трансдукции кератиноцитов человека. |
| Пробирки для микроцентрифуг Safe-Lock, объем 1,5 мл | Eppendorf | 0030 120.086 | Пробирки для приготовления разбавления. |
| Микроцентрифужные пробирки Safe-Lock, объем 2 мл | Eppendorf | 0030 120.094 | Пробирки для приготовления разбавления. |
| 0,2 мл ПЦР-пробирки с плоскими колпачками, РНКаза, ДНКаза, ДНК и ПЦР-ингибиторы без | любых) | пробирок для полуколичественной ПЦР. | |
| MicroAmp Fast Optical 96-луночный реакционный планшет со штрих-кодом, 0,1 мл | прикладной биосистемы | 4346906 | 96 лунок для qRT-PCR. |
| Полистирольная трубка с круглым дном объемом 5 мл, без колпачка | BD Falcon | 352052 | пробирки для получения проточной цитометрии. |
| Одноразовые серологические пипетки, полистирол, в индивидуальной упаковке, стерильные (разного объема) | (любые) | - | пипетки для стерильных культур тканей. |
| Фильтрующие наконечники, стерильные и РНКазы, ДНКазы, ДНК и пирогены (разного объема) | (любой) | - | Фильтрующие наконечники для стерильных тканей и молекулярной биологии. |
| pH-метр | (любой) | - | Оборудование для измерения pH HBS 2X. |
| Термоамплификатор ПЦР | (любой) | - | Оборудование для полуколичественной ПЦР. |
| Оборудование для электрофореза в агарозном геле | (любое) | - | Оборудование для электрофореза в агарозном геле методом полуколичественной ПЦР. |
| BD FACS Canto II 2LSR 4/2 | BD-Flow | цитометр. | |
| 7900HT Быстрая система ПЦР в реальном времени | Прикладная биосистема | 7900HT | оборудование для qRT-PCR. |
| Настольные центрифуги для эффективной обработки образцов в клеточных культурах, охлаждаемые, с ведрами для микропланшетов. | (любая) | - | Центрифуга для обработки клеточных культур и спинокуляции. |
| Ультрацентрифуга Optima L-90K оснащена ротором SW32TI | Beckman Coulter-Ultracentrifuge | для производства лентивирусных частиц. | |
| Оборудование для лабораторий клеточных культур и молекулярной биологии (например, колпак класса II, предназначенный для работы с материалами BSL2, инкубатор для клеточных культур, холодильники и морозильники (+4 ° С, -20 и град; С, -80 °°; В), микропипетки и пипетки). | |||
| Защитные лабораторные халаты, перчатки, средства защиты лица в соответствии с правилами и нормами Института, в частности для производства и передачи лентивирусных частиц. |
Ссылки
- Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
- Maiti, S. N., et al. Sleeping....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
