本文详细描述了一种简便的点印迹法，用于定量腺相关病毒（AAV）滴度，并介绍了该方法在研究组装激活蛋白（AAPs）中的应用。AAPs是一类在所有AAV血清型中发现的新型非结构病毒蛋白，可促进同源及异源AAV血清型衣壳的组装。
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本文内容
摘要
摘要
尽管腺相关病毒（AAV）被广泛认为是基因治疗中一种理想的载体，它同时也被用作研究病毒生物学的模型病毒。在这一领域，近期发现了一种非结构蛋白——称为组装激活蛋白（AAP），为理解病毒衣壳VP蛋白组装成完整衣壳的过程提供了新的视角。尽管许多AAV血清型的组装依赖于AAP，但我们最近的研究表明，AAV4、AAV5和AAV11是这一规律的例外。此外，我们还发现不同血清型的AAP及其组装完成的衣壳定位于不同的亚细胞区域。这种在不同AAV血清型之间AAP生物学特性与功能作用上的意外异质性，凸显了对来自多种血清型的AAP进行研究的重要性。本文详细描述了一种简便的点印迹（dot blot）检测方法，用于AAV的定量，并应用于评估衣壳组装过程中对AAP的依赖性及血清型特异性。为了展示该点印迹检测方法的应用价值，我们对一种此前未被表征的爬行动物AAV——Snake AAV的衣壳组装特性及其对AAP的依赖性进行了分析，同时纳入了已知不依赖AAP的AAV5和依赖AAP的AAV9作为对照。检测结果显示，Snake AAV的衣壳组装需要Snake AAP，而AAV5和AAV9的AAP无法促进其组装。此外，该检测还表明，与许多可通过交叉互补促进异源衣壳组装的常见血清型AAP不同，Snake AAP不能促进AAV9衣壳的组装。另外，我们发现核酸酶的选择显著影响点印迹检测的结果，因此，选择最适酶对于准确测定AAV滴度至关重要。
引言
腺相关病毒（AAV）是一种小型、无包膜、单链DNA病毒，其基因组大小约为4.7千碱基（kb）。AAV基因组包含编码rep和cap基因的开放阅读框（ORFs）。2010年，Sonntag 等发现了一种此前未被识别的非结构蛋白，该蛋白由AAV2 cap基因内一个+1移码的开放阅读框编码，被证实对AAV2衣壳VP单体蛋白组装成病毒衣壳具有关键作用1。由于该蛋白在促进衣壳组装中发挥功能，这一新型蛋白被命名为组装激活蛋白（assembly-activating protein, AAP）1。
AAP 的开放阅读框（ORF）已通过生物信息学方法在 Dependoparvovirus 属所有细小病毒的基因组中被鉴定出，但在细小病毒科其他属病毒的基因组中未发现1,2。对该新型蛋白的功能研究最初集中于原型腺相关病毒2型（AAV2）的 AAP（AAP2），已证实 AAP2 在将未组装的 VP 蛋白靶向至核仁以积累并形成完整组装衣壳的过程中发挥关键作用1,3,<....
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方案
注意：本方案所需溶液和缓冲液的配制方法见表1。下述方案针对VP-AAP交叉互补点印迹实验，用于研究AAP蛋白在衣壳组装中的作用。更通用的纯化AAV载体滴度定量点印迹实验方法详见代表性结果部分。
1. VP3、AAP 和 AAV2 Rep 表达质粒的构建
- pCMV-AAVx-VP3（x = 血清型）的构建
- 使用高保真DNA聚合酶及以下引物对，通过PCR扩增整个VP3开放阅读框（1.6 kb）：VP3上游引物，CTAA-RE1-CACC-N25 （VP3 ORF 的前25个核苷酸）；VP3 反向，TCTT-RE2-N25 （VP3 ORF 的最后25个核苷酸）。
注意：RE1 和 RE2 是用于克隆的限制性内切酶（REs）位点。CTAA 和 TCTT 是添加至双链 DNA 末端附近的 5' 和 3' 端四核苷酸序列，以促进限制性内切酶消化。CACC 是 Kozak 共识序列。 - 将经限制性内切酶（RE）消化的PCR产物克隆至哺乳动物表达载体相应的RE位点中，该载体采用人巨细胞病毒即刻早期（CMV-IE）增强子-启动子以实现高水平表达。
注意：进行分子克隆时，消化 5 µg 用限制性内切酶以每微克4单位的浓度对骨架质粒DNA进行酶切µg DNA在最....
- 使用高保真DNA聚合酶及以下引物对，通过PCR扩增整个VP3开放阅读框（1.6 kb）：VP3上游引物，CTAA-RE1-CACC-N25 （VP3 ORF 的前25个核苷酸）；VP3 反向，TCTT-RE2-N25 （VP3 ORF 的最后25个核苷酸）。
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结果
大规模制备的纯化AAV载体库存液定量点印迹结果的代表性示例如下所示 图1通过该点印迹法测定了双链AAV2G9-CMV-GFP病毒载体储备液的滴度。该载体经两轮氯化铯（CsCl）密度梯度超速离心纯化，随后进行透析，具体方法如前所述。20通常情况下，对于纯化的AAV载体储备液，每种AAV载体储备液需取三个不同的体积例如, 0.3 µL, 0.1 µL，以及 0.03 µL) 采用上述点印迹实验步骤进行重复实验，其中以DNase I酶A替代 S. marcescens 在步骤3.2中使用内切核酸酶，在步骤3.4中使用市售试剂盒提取和纯化病毒DNA（参见 材料清单）。在所示的示例中 图1，从每个质粒DNA标准品获得的信号强度值（任意单位）（图1A) 根据已知的DNA量绘制标准曲线（
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讨论
本报告描述了定量点印迹法在研究 AAV AAP 及其在衣壳组装中作用方面的应用价值。这些研究获得的知识可为不同血清型之间 AAV 衣壳组装过程的内在差异以及 AAP 的功能角色提供详细的见解。在这方面，AAV VP3-AAP 互补点印迹实验表明，Snake AAV VP3 在衣壳组装过程中严格依赖其同源 AAP 的共表达，而 Snake AAP 不能促进异源血清型的衣壳组装。这一现象引人关注，因为此前研究过的依赖 AAP 的 AAV 血清型（AAV1、2、3、6、7、8、9 和 12）均能够在一定程度上利用异源 AAP 完成组装6。
定量点印迹或狭缝印迹杂交是一种传统方法，可方便地同时定量多个样品中的核酸含量25。在20世纪90年代qPCR普及之前，该方法已被广泛用于DNA和RNA的定量26,27。尽管qPCR在灵敏度更高、动态范围更广方面优于定量点印迹及其他基于杂交的检.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢北卡罗来纳大学教堂山分校的 Xiao Xiao 提供 pEMBL-CMV-GFP 质粒。感谢 Christopher Cheng 和 Samuel J. Huang 对手稿的审阅。本研究得到了公共卫生服务基金（NIH R01 NS088399 和 T32 EY232113）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 苯并核酸酶 | MilliporeSigma | 1016970001 | 在正文中的名称为 Serratia marcescens 内切核酸酶。 |
| DNase I | Roche | 4716728001 | 在正文中的名称为 DNase I 酶 A。 |
| DNase I | Invitrogen | 18047019 | 在正文中的名称为 DNase I 酶 B。 |
| DNase I | New England Biolabs | M0303L | 在正文中的名称为 DNase I 酶 C。 |
| 1.5 mL 带O型圈螺口离心管 | Corning | 430909 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL 聚丙烯圆锥形离心管 | Corning | 352097 | |
| 3 M 醋酸钠 | Teknova | S0298 | |
| 50 mL 聚丙烯圆锥形离心管 | Corning | 430291 | |
| AAV-293 细胞 | Agilent | 240073 | 用于包装 AAV 病毒颗粒的优化 HEK-293 细胞系。 |
| AccuGENE 0.5 M EDTA 溶液 | Lonza | 51234 | |
| AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
| AccuGENE 10% SDS | Lonza | 51213 | |
| AccuGENE 1X TE 缓冲液 | Lonza | 51235 | |
| Bio-Dot 装置 | Bio-Rad | 1706545 | |
| 牛血清白蛋白 | MilliporeSigma | A3294 | |
| 细胞刮刀 | Corning | 3008 | |
| 氯仿 | MilliporeSigma | 372978 | |
| DNA 提取试剂盒 | Wako Pure Chemical Industries | 295-50201 | 用于纯化病毒的定量点杂交实验。我们仅使用制造商提供的说明书方案2中每一步推荐试剂体积的一半。 |
| Dulbecco’s 改良伊格尔培养基（DMEM）-高糖（4.5 g/L） | Lonza | 12-614F | |
| ElectroMAX DH10B 细胞 | Thermo Fisher Scientific | 18290015 | |
| 200 证明乙醇 | Decon Labs | 2716 | |
| 胎牛血清 | VWR | 1500-500 | |
| Ficoll 400 | Alfa Aesar | B22095 | 在文中称为多聚蔗糖 400。 |
| 荧光显微镜 | Zeiss | Axiovert 40 CFL | |
| 糖原 | Roche | 10901393001 | |
| 鲱鱼精子 DNA | Invitrogen | 15634-017 | |
| 杂交管 | Thermo Fisher Scientific | 13-247-150 | |
| ImageQuant TL | GE Healthcare Life Sciences | ImageQuant TL | |
| L-谷氨酰胺 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| 六水合氯化镁 | MilliporeSigma | M0250 | |
| MicroPulser 电穿孔仪 | Bio-Rad | 1652100 | |
| Mini Quick Spin DNA 柱 | MilliporeSigma | 11814419001 | |
| pAAV-RC2 载体 | Cell Biolabs Inc | VPK-422 | |
| 青霉素/链霉素 10K/10K | Lonza | 17-602E | |
| 磷酸盐缓冲液 | Lonza | 17-516F | |
| 磷屏成像曝光盒 | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| 磷屏成像板 | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| 质粒大提试剂盒 | QIAGEN | 12162 | |
| Platinum Pfx DNA 聚合酶 | Invitrogen | 11708013 | |
| 聚乙烯亚胺 | Polysciences Inc | 23966-2 | |
| 聚乙烯吡咯烷酮 | MilliporeSigma | P5288 | |
| Prime-It II 随机引物标记试剂盒 | Agilent Technologies | 300385 | |
| 引物 AAP 正向（N25 为 AAP ORF 第4个核苷酸起始的25个核苷酸，RE1 为用于克隆的限制性内切酶位点）：CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA CGACGATGACAAA-N25 | MilliporeSigma | 定制引物 | |
| 引物 AAP 反向（N25 为 AAP ORF 最后25个核苷酸，RE2 为用于克隆的限制性内切酶位点）：TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | 定制引物 | |
| 引物 VP3 正向（N25 为 VP3 ORF 起始的25个核苷酸，RE1 为用于克隆的限制性内切酶位点）：CTAA-RE1-CACC-N25 | MilliporeSigma | 定制引物 | |
| 引物 VP3 反向（N25 为 AAP ORF 最后25个核苷酸，RE2 为用于克隆的限制性内切酶位点）：TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | 定制引物 | |
| 蛋白酶 K 溶液 | Invitrogen | 25530-049 | |
| 限制性内切酶 | New England Biolabs | Various | |
| 鲑鱼精子 DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| 血清移液管 | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11 | |
| 氯化钠 | Thermo Fisher Scientific | S271-10 | |
| 三碱柠檬酸钠二水合物 | MilliporeSigma | C8532 | |
| T4 DNA 聚合酶 | New England Biolabs | M0203L | |
| PCR 仪 | Eppendorf | 6321000515 | |
| 组织培养处理的 6 孔板 | Corning | 353046 | |
| Tris 碱 | Thermo Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28955809 | |
| UltraPure 缓冲饱和酚 | Invitrogen | 15513-047 | |
| 紫外交联仪 | Spectroline | XLE-1000 | 使用最佳交联模式，提供 120 mJ/cm2 的紫外能量剂量。 |
| Zeta-Probe 膜 | Bio-Rad | 162-0165 |
参考文献
- Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
- Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein p....
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