펩타이드 기반 매트릭스 샘플을 고정 하는 포 르 말린의 최적의 준비 지원 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 이미징 워크플로

요약

이 프로토콜의 포 르 말린 고정 조직을 이미징 질량 분석에 대 한 운명 승화 기반 준비에 대 한 재현 가능 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다.

초록

매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화를 사용 하 여, 질량 분석 이미징 (MALDI MSI) 급속 하 게 확장 했다, 때문에이 기술은 분석 N-glycans에 약물과 지질에서 생체의 호스트. 다양 한 샘플 준비 기술 존재 감지 포름알데히드 보존 조직에서에서 펩 티 드 대량 spectrometric 분석의이 유형에 대 한 가장 어려운 문제 중 하나 남아 있다. 이러한 이유로, 우리 만든 고 최적화 ionizable 펩 티 드의 가장 큰 수를 도출 하는 동안 샘플에 포함 된 공간 정보를 유지 하는 강력한 방법. 우리는 또한 목적 비용 효과적이 고 간단한 방법으로 이것을 달성 함으로써 계측 자동화를 사용 하 여 때 발생할 수 있는 잠재적인 편견 또는 준비 오류를 제거. 최종 결과 저렴 하 고 재현할 수 프로토콜.

서론

매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석기 (MALDI MSI) 이미징 대 한 2 년간^1,2, 생체 등의 범위를 분석 이미지 기반 기술로 고용 되었다: 지질³, 펩 티 드^{2 ,4}, 단백질^2,5, 대사^6,7, N-glycans⁸및 치료 약물^9,10같은 합성 분자. 이 기술은의 유틸리티를 시연 하는 간행물의 수는 지난 10 년간^6,11,,1213이상 크게 성장....

프로토콜

주의: 모든 적용 가능한 안전 주의 사항은 따라야 할 적절 한 개인 보호 장비 (PPE) (예: 실험실 코트, 니트 릴 장갑, 안전 안경, 등)의 사용을 포함 하 여이 절차를 수행할 때

1입니다. 시 약 및 장비 준비

1. 솔루션의 준비
   1. Carnoy의 액체의 500 mL, 혼합 준비 100% 에탄올 (EtOH), 클로 프롬, 및 6에 빙 초 산: 깨끗 한 유리병 쇼트에서에서 3:1 v/v/v 비율.
   2. 액체 니트로 (NC)을 하려면 부드러운 동요 40 mg/mL의 최종 농도에 의해 NC 멤브레인 (일반적으로 서쪽에 게 더 럽 히기에서 사용 되는) 깔끔한 아세톤에 녹.
2. NC의 준비 코팅 슬라이드
   1. 조직학 시험²⁰ NC 준비 얼룩 혈액의 준비를 위해 사용 하는 것과 비슷한 기술을 사용 하 여 슬라이드 코팅.
   2. 도전성 인듐 주석 산화물 (ITO) 현미경 슬라이드의 한 가장자리에 액체 NC의 40 µ L 플라스틱 일반 유리 현미경 슬라이드를 사용 하 여도 박막 코팅을 만들 슬라이드 표면 장력에....

결과

정확 하 게 따라 하는 경우이 프로토콜 명확 하 게 어떤 찰 상 또는 다른 변형 (그림 1) 없이 조직의 심한 형태를 나타내는 이미지를 생성 합니다. 올바르게 수행된 샘플 준비를 위한 이상적인 유효성 검사 되는 분자를 변경 하 여 다른 물리적 구조 사이 구별 하는 기능 (그림 2) 볼 이다.

샘플 제대로 준비 된 하지 하는 경우를 결정 하기 위한 좋은 가이드 delocalization 또는 매트릭스 집계;의 존재를 확인 하는 것입니다. 실제 조직의 경계를 넘어 확장 하는 펩 티 드 시그니처는 분자 견본 준비 동안 이동한 완벽 한 지표. 이것은 오 러키와 Padula에 자세히 설명 (2017)¹⁵.

토론

이 프로토콜은 analytes의 delocalization를 제거 하는 동안 ionizable 분자 종의 생성을 극대화 하도록 설계 되었습니다. 매트릭스, 샘플, 소화 또는 승화²⁴; 후 recrystallizing를 적용할 때 동일한 재정의 원리를 사용 하 여 포함 하는 주요 요인 즉, 그의 증기도 증 착 매트릭스 또는 그렇지 않으면, 창조 되 고 유지 필요. Recrystallization와 소화, 균등 하 게 샘플을 아래에 대 한 용 매 세척 pipetting 곳 보다 더 많은 용 매 증기를 받고 개별 영역을 방지 합니다. 이 보이는 응축의 대형을 방지 하기 위한 중요 한 이며 전반적인 delocalization 샘플은 균등 하 게 소화 하 고 박막 뿐만 아니라 표면 분자를 억제. 그것은 절대적으로 너무 작고 상대적으로 낮은 강도 및 종의 다양성을 보여줄 것이 서 행렬의도 증 착을 달성 하 고 또한 강도와 종²⁵의 다양성을 낮추는 샘플에서.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Cryo Microtome	Leica	CM3050	조직 준비 및 절편용.
인듐 주석 산화물 현미경 슬라이드	Bruker	8237001	조직 준비 및 절편용.
Coplin Jars	Sigma Aldrich	S5516	조직의 준비 및 단면용.
압력솥	Kambrook	KPR620BSS	준비 및 조직 절단용.
Sublimator	Chem Glass	NA	승화 절차용. CG-3038과 디자인이 비슷하지만 맞춤 제작되었습니다
모래 목욕	NA	NA	승화 절차에. 특정 회사가 아닌 외부에서 공급된 접힌 알루미늄 호일에 담긴 고급 강 모래
유리 페트리 접시	시그마 알드리치	CLS70165100	승화 절차용.
진공 펌프	NA	NA	승화 절차용. 오래된 질량 분석기의 예비 부품으로 공급
콜드 트랩	화학 유리	CG-4510-02	승화 절차용.
핫 플레이트	존 모리스	EW-15956-32.	승화 절차용.
플라스틱 페트리 접시	시그마 Aldrich	Z717223	승화 절차용.
37 &도; C 인큐베이터	NA	NA	승화 절차용. 해당 없음, 인큐베이터는 비멸균이며 30년 이상 되었습니다
블로팅 페이	Sigma Aldrich	P7796	승화 절차용.
니트로셀룰로오스	시그마 알드리치	N8395	슬라이드 세척용.
아세톤	시그마 알드리치	650501	슬라이드 세척용.
Xylene	Sigma Aldrich	214736	슬라이드 세척용.
100% EtOH	시그마 알드리치	1.02428	슬라이드 세척용.
70% EtOH	Sigma Aldrich	NA	슬라이드 세척용. 95%의 주식 에탄올로 실험실에서 제작
클로로포름	시그마 알드리치	C2432	슬라이드 세척용.
빙하 아세트산	시그마 알드리치	ARK2183	슬라이드 세척용.
Tris HCL pH 8.8	Sigma Aldrich	TRIS-RO	단백질 분해 절단용. 1M로 만든 분말, 32% HCl로 평형을 이루어 PH 8.8
Milli Q 초순수	시그마 Aldrich	NA	단백질 분해 절단용. sartorious 정수 시스템
암모늄 비르카보네이	시그마 알드리치	A6141	단백질 분해 절단을 위해.
Trypsin	Sigma Aldrich	T0303	단백질 분해 절단용.
CHCA 매트릭스	시그마 Aldrich	C2020	재결정용.
아세토니트릴	시그마 알드리치	1.00029	재결정용.
트리플루오로아세트산(TFA)	Sigma Aldrich	302031	재결정용.

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