一种基于动力学荧光的 Ca2+ 流动检测方法，用于鉴定 G 蛋白偶联受体激动剂、拮抗剂及别构调节剂

摘要

所述细胞检测旨在鉴定能够抑制或刺激CXC趋化因子受体4（CXCR4）相互作用的试剂，这些试剂可通过竞争性或变构方式抑制或激活由CXCR4激活引发的细胞内Ca²⁺ 释放。

摘要

G蛋白偶联受体（GPCRs）在制药行业中具有重要意义，因其参与多种人类疾病的发生发展，并包含多个已被充分验证的治疗干预靶点。发现能够特异性抑制受体功能的先导化合物（包括小分子合成化合物）是药物开发的重要初始步骤，依赖于灵敏、特异且稳健的基于细胞的检测方法。本文描述了一种以荧光信号为读数的动态细胞检测方法，主要用于鉴定特异性拮抗剂，这些拮抗剂可抑制由内源性配体CXC趋化因子配体12（CXCL12）激活CXC趋化因子受体4（CXCR4）所引发的细胞内Ca²⁺释放。该方法的一个关键优势在于，它还能用于筛选具有内在激动活性的化合物（即，在无CXCL12存在时可诱导细胞内Ca²⁺浓度升高的化合物），或通过结合变构位点来调节受体功能的化合物（即，正向和负向变构调节剂（PAMs和NAMs））。其局限性在于，具有自发荧光的化合物可能干扰检测信号，从而影响数据的可靠解读。该检测方法很可能只需极少的调整，即可作为通用药物筛选平台，适用于其他多种激活后可引起细胞内Ca²⁺释放的GPCRs。

引言

G蛋白偶联受体（GPCR）是一类重要的细胞表面蛋白超家族，可在胞外配体结合后激活信号转导级联反应。它们可被多种刺激物激活，包括肽类、蛋白质激素、生物胺和脂质，从而启动多种细胞内信号通路，并最终引发生物学反应^1,2。此外，GPCR参与了大多数（如果不是全部）发育和生理过程，许多人类疾病与GPCR信号功能障碍或受体过度表达相关。因此，GPCR是医学领域中最为公认的药物靶点之一^1,3。

通常，GPCR药物发现的工作流程始于细胞筛选实验，以鉴定能够调节特定GPCR活性的化合物，例如小分子、单克隆抗体和多肽。在GPCR药物发现中，存在多种不同类型的检测方法用于寻找此类化合物，其中大多数方法适用于中至高通量筛选项目。最常用的检测方法包括受体结合实验、基于荧光或发光检测所谓第二信使（例如，Ca²⁺、环磷酸腺苷（cAMP））水平变化的检测、表型筛选实验以及β-阻遏蛋白（β-arrestin）招募检测⁴。选择特定类型的检测方法可能取决于多种因素，但也受到对特定GPCR信号传导特性的已有知识的影响。激动剂与GPCR结合后会诱导构象变化，催化异源三聚体G蛋白α亚基上的鸟苷二磷酸（....

方案

注意：第1和第2部分所述的所有步骤均须在超净工作台内的无菌条件下进行。

1. U87.CD4.hCXCR4 细胞的维持

1. 在37 °C、5% CO₂条件下，于T75培养瓶中培养细胞₂ 在湿润的培养箱中。
   注意： 体外 本方案中使用的细胞系是一种稳定表达分化簇4（CD4）和人源CXCR4的U87胶质母细胞瘤细胞系，此前已有描述¹⁷细胞表面 CD4 和 CXCR4 的表达通过流式细胞术持续监测，表达水平随时间保持稳定（约 100% CD4）⁺ 和约 100% CXCR4⁺ 细胞）。本方案不涉及所用细胞系的建立及通过流式细胞术检测受体表达水平的详细操作步骤。
   1. 在细胞汇合度达到80-85%时进行传代培养。所有试剂在用于细胞培养前应恢复至室温（RT）。
   2. 从细胞中移除培养过的培养基，用 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）将细胞单层洗涤一次。
   3. 加入3 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，并均匀覆盖于细胞单层表面。随后吸除多余的胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育最多5分钟，直至细胞开始脱落。
   4. 加入10 mL新鲜的完全培养基（DMEM + 10%胎牛血清（FBS）+ 0.01 M HEPES + 适当的筛选试剂）。轻轻吹打重悬细胞。将细胞悬....

结果

CXCL12 刺激对细胞内 Ca²⁺ 水平的影响²⁺ U87.CD4.CXCR4 中的动员⁺ 以及U87.CD4细胞通过Ca进行评估²⁺ 迁移实验。而不是 20 µL 在方案的第一步移液操作中通常要加入的待测化合物图1），将检测缓冲液加入负载了fluo-2 AM的U87.CD4.CXCR4细胞中⁺ 测量板中的细胞。在第二次加样步骤中，向测量板中加入不同浓度的CXCL12（终浓度为0.2–102.4 nM）。荧光信号呈剂量依赖性增强，与Ca释放的剂量依赖性增加相关²⁺，已展示（图2A）。此处，阴性对照样品代表在两次加样中仅向检测板加入测定缓冲液的孔即，0 nM CXCL12），导致无反应（图 2A）。CXCL12 浓度越高，诱导产生的荧光水平也越高，但荧光信号随时间逐渐衰.......

讨论

Ca²⁺-本文所述的趋化实验此前已被证明是识别和表征靶向CXCR4受体拮抗剂的有效工具¹⁷然而，预计该方法可更广泛地应用于大量其他可触发胞质 Ca²⁺ 激活后释放，如相关趋化因子受体 CCR5 所示。尽管在 CCR5 的情况下可应用完全相同的实验条件，但本方案中的多个步骤（例如，铺板时的细胞数量、细胞加载荧光染料的条件等参数在将该检测方法应用于其他G蛋白偶联受体（GPCR）之前，均需重新优化，以获得理想的信噪比。此处另一个重要问题是选择合适的 体外 允许目标G蛋白偶联受体高水平表达并实现与Ca功能偶联的细胞宿主²⁺ 通路。对于CXCR4，选择人胶质母细胞瘤U87细胞的原因如下：（1）该细胞不表达内源性CXCR7（一种与CXCR4共用相同激动剂的相关趋化因子受体）；（2）它们能够将CXCR4的激活与Ca²⁺信号通路，(3) 细胞负载Ca²⁺指示剂后获得的荧光响应具有良好的动态范围²⁺-敏感染料，以及（4）它们对检测板的良好黏附性，可在整个实验过程中.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Fluo-2 AM	Abcam	ab142775	荧光性 Ca²⁺ 敏感性染料
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G	泊洛沙酸
明胶	Sigma	G9391
AMD3100	Sigma	A5602-5 mg	特异性 CXCR4 拮抗剂
马拉维若	AnorMed 慷慨赠予		抗逆转录病毒药物，CCR5 拮抗剂
趋化因子配体 CXCL12	PeproTech	300-28A
趋化因子配体 CCL5	PeproTech	300-06
胎牛血清（FBS）	Gibco (Life Technologies)	10270-106
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A1933-25G
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco (Life Technologies)	41965-039
HBSS（10 倍浓度），含钙、含镁，不含酚红	Gibco (Life Technologies)	14065-049
HEPES（1 M）	Gibco (Life Technologies)	15630-056
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红	Gibco (Life Technologies)	25200-056
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）	Gibco (Life Technologies)	14190-094
Falcon 管，50 mL	Greiner Bio-One	227 261
组织培养瓶（T75）	Corning	353024
黑色 96 孔板，透明平底，带盖	Costar/Fisher Scientific	10530753	用于细胞接种的检测板（96 孔）
聚丙烯（PP）板	Thermo Scientific (VWR)	732-2661	用于制备化合物板和趋化因子板的圆底板
FLIPR Tetra 高通量细胞筛选系统	Molecular Devices		集成移液头和 ICCD 相机的荧光酶标仪
FLIPR Tetra LED 模块 470 - 495 nm	Molecular Devices	0200-6128	用于激发荧光性 Ca²⁺ 敏感性染料的发光二极管
FLIPR Tetra 发射滤光片 515 - 575 nm	Molecular Devices	0200-6203	与荧光染料兼容的发射滤光片
FLIPR Tetra 96 孔头	Molecular Devices	0310-4536	集成于荧光酶标仪内的 96 孔移液头
ScreenWorks	Molecular Devices		用于 FLIPR Tetra 数据分析与可视化的软件包
Vi-CELL	Beckman Coulter		细胞活力分析仪
Corning CellBIND 96 孔平底透明黑色聚苯乙烯微孔板，带盖，无菌	Corning	3340	预包被的 96 孔检测板，可作为检测板手动包被的替代方案。