Microscopia com base em métodos de avaliação da migração de células epiteliais durante a cicatrização em Vitro

Summary

Este manuscrito descreve como incisão lesões-feitas em monocamadas de células epiteliais culta convenientemente modelo ferida cura em vitro, que permita a para a imagem latente confocal ou microscopia de varredura a laser, e que pode proporcionar alta qualidade dados quantitativos e qualitativos para estudar tanto o comportamento da célula e os mecanismos envolvidos na migração.

Abstract

Migração celular é um aspecto obrigatório para cicatrização de feridas. Criação artificial feridas em modelos animais de pesquisa muitas vezes resulta em procedimentos experimentais caros e complicados, enquanto potencialmente carente de precisão. Cultura in vitro de linhas de células epiteliais fornece uma plataforma adequada para pesquisar o comportamento de células migratórias na cicatrização de feridas e o impacto de tratamentos nessas células. A fisiologia das células epiteliais é frequentemente estudada em condições não-confluente; no entanto, esta abordagem pode não se assemelham a ferida natural, condições de cura. Rompendo a integridade do epitélio por meios mecânicos, gera um modelo realista, mas pode impedir a aplicação de técnicas moleculares. Consequentemente, as técnicas de microscopia com base são ideais para estudar a migração de células epiteliais in vitro. Aqui nós detalhe dois métodos específicos, o ensaio de zero ferida artificial e o ensaio de migração artificial frontal, que pode obter dados quantitativos e qualitativos, respectivamente, sobre o desempenho migratório das células epiteliais.

Introduction

Migração celular é necessária para a cicatrização de feridas, como é responsável para o fechamento final do gap epitelial e restauração da superfície interrompidos¹. Apresentando ferimentos artificiais em modelos animais permite a replicação deste complexo processo em perto de condições fisiológicas². No entanto, esta abordagem muitas vezes resulta em procedimentos experimentais caros e complicados, que potencialmente carecem de precisão para o estudo de processos distintos, devido à natureza complexa do processo de cicatrização de feridas.

Cultura in vitro de linhas de células epitel....

Protocol

1. artificial ferida ensaio zero para estudos quantitativos

1. Preparação de monocamadas de células
   1. Trabalhando sob condições estéreis, de sementes e desenvolvem-se células epiteliais Mv1Lu ou HaCaT em frascos de cultura usando meio de soro-completada. Atualize médio uma vez cada 24-48 h. Depois que as células alcançar 80% de confluência, desanexe células usando um método adequado, ou seja, tripsinização⁹.
      Nota: Mv1Lu HaCaT linhas de células epiteliais são cultivadas usando meio de cultura EMEM e DEMEM, respectivamente, suplementado com 2 mM L-glutamina e incubadas a 37 ° C, com uma atmosfera co....

Results

Ensaio de zero ferida artificial para estudos quantitativos: avaliação fator de crescimento epidérmico (EGF) promoção da migração:

EGF é um conhecido indutor de proliferação de células epiteliais e migração e, portanto, um controle positivo para quantificar a promoção de migração. Monocamadas de células Mv1Lu e HaCaT foram utilizadas em ensaios de zero a ferida e pré-tratamento fotos foram obtidas. Após a inoculação com 10 ng/mL EG.......

Discussion

Em cima da pele ou mucosa interrupção, função de barreira é restaurada pelas ações de numerosos tipos de células, incluindo fibroblastos ou células epiteliais e imunes. Em conjunto, estas células passam por um complexo processo envolvendo a apoptose, proliferação, diferenciação e importante, fibroblastos e epiteliais células migração, que é o derradeiro mecanismo responsável pela restauração do tecido interrompida e o encerramento do fosso epitelial superficial^1,12

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)	Biowest, Nuaillé, França	L0102-500	Suplemento FBS opcional a 10 %
Eagles' s Meio Essencial Mínimo (EMEM)	Lonza	BE12 -662F	Suplemento FBS opcional de 10%
L-Glutamina	Lonza	BE17-605E	Uso a 2 mM
Soro Fetal Bovino (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA EUA	DE17603A
Tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA	T4049	Diluir conforme apropriado
Poli-L-Lisina	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA	P9155
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x)	Gibco da Life Technologies	14200-067	Diluir para 1x
placas de cultura de 24 poços	BD FALCON//SARSTED	734-0020
Placas de cultura de 6 poços	SARSTEDT	83-3920
Fator de Crescimento Epidérmico (EGF)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	E9644	Usado 10 ng/mL
Vidro de cobertura redondo	MENZEL-GLÄ SER	MENZCB00120RA020	PROFUNDIDADE DE CAMPO CURTA
Lâmina de barbear reforçada nº 743	Martor (através da VWR)	MARO743.50
200 µ l ponteiras de aerossol estéreis	VWR	732-0541
20 µ l pontas de pipeta de aerossol estéril	VWR	732-0528
Microscópio de contraste de fase acoplado com câmera digital	Motic Espanha	Câmera Moticam 2300 3,0 M Pixel USB 2.0; Microscópio confocal óptico Motic AE31
	ZEISS Microimaging, Alemanha	LSM 510 META
10 cm Placa de cultura	BD FALCON	353003
Anticorpo policlonal anti-c-Jun de coelho	Santa Cruz Biotechnology	sc-1694	Usado 1:100
Anti-coelho IgG (cabra policlonal) AF 488	Invitrogen	A11008	Usado 1:400
Hoechst-33258	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	14530	Usado 1:1000
Alexa Fluor 594 faloidina (em metanol) (vermelho)	Invitrogen	A12381	Usado 1:100
Soro Bovino	Albumina Santa Cruz Biotechnology	SC-2323
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	T9284
Leite desnatado	BD DIFCO	232100
ImageJ	National Institutes of Health, EUA	Release 1.50i
Zen LSM 510 software de processamento de imagem	ZEISS Microimaging, Alemanha	Release 5.0 SP 1.1