نقدم هنا، بروتوكولا لتقييم تأثير الببتيدات على هجرة الخلايا الظهارية الشعب الهوائية. يسمح هذا الأسلوب للحصول على بيانات كمية عن سرعة الإغلاق الهجرة والجرح خلية السريع واستنساخه بدرجة عالية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
رواية في المختبر الجرح المقايسة الشفاء لتقييم الهجرة الخلية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
والهدف من هذا العمل لإظهار طريقة جديدة لتقييم قدرة بعض الجزيئات إيمونومودولاتوري، مثل الببتيدات المضادة للميكروبات (الامبير)، حفز الهجرة الخلية. الأهم من ذلك الهجرة الخلية حدث الحد من معدل أثناء عملية التئام إعادة تأسيس سلامة ووظيفة طبيعية من طبقات الأنسجة بعد الإصابة. ميزة هذا الأسلوب على التحليل الكلاسيكي، الذي يستند إلى الصفر يدوياً صنع في أحادي الطبقة خلية، إدراج استخدام الثقافة السيليكون الخاصة توفير حجرات اثنين لإنشاء حقل تجرح شبه خالية من خلية مع عرض المعالم (500 ميكرومتر ). وبالإضافة إلى ذلك، من الممكن سبب منصة تحليل صورة الآلي، سرعة الحصول على البيانات الكمية على سرعة الهجرة خلية وإغلاق الجرح. أكثر دقة، سيظهر أثر اثنين جلد الضفدع الامبير على هجرة الخلايا الظهارية الشعب الهوائية. وعلاوة على ذلك، ستوفر المعالجة المسبقة لهذه الخلايا مع مثبطات محددة معلومات عن الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه الأحداث.
المقدمة
ومن المعروف أنه إلى حد كبير أن التئام الجروح في الحيوانات عملية أساسية إعادة تأسيس سلامة ووظيفة طبيعية من طبقات الأنسجة بعد الإصابة1. وبالرغم من الأسطح الظهارية المعرضة للبيئة الخارجية (مثل الجلد، والجهاز التنفسي، والجهاز الهضمي المسالك) تشكل حاجزاً واقيا من الشتائم الفيزيائية والكيميائية، وتشكيل الجروح يمكن أن تحدث بسهولة، لا سيما بعد الجراحة أو العدوى الميكروبية2. على سبيل مثال، استعمار أنسجة الرئة بمسببات المرض البكتيري الانتهازية الزّنجاريّة Pseudomonas، خاصة في مرضى التليف الكيسي (CF)، يؤدي إلى الأضرار من ظهارة الخطوط الجوية مع ما يترتب عليه من فشل الجهاز التنفسي3،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-إعداد الخلية
- البذور 2.5x106 خلايا في 10 مل من المتوسطة الأساسية الدنيا (MEM) تستكمل مع الجلوتامين 2 مم (ميمج)، بالإضافة إلى 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والمضادات الحيوية (0.1 مغ/مل من البنسلين وستربتوميسين) بوروميسين (0.5 ميكروغرام/ملليلتر لاختيار وصيانة الخلية خط) في قارورة T75. احتضان قارورة على 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة يومين. قبل البدء التجربة، تحقق التقاء الخلايا تحت مجهر مقلوب.
ملاحظة: الخلايا المستخدمة للتجربة هي مخلدة الخلايا الظهارية الشعب الهوائية الإنسان عشر ترانسدوسيد مع ناقل لينتيفيرال منح المقاومة إلى بوروميسين. ستابلي يعربون عن14،CFTR فنية15. - بمجرد ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هذا البروتوكول المستخدم لتحديد الجرح الشفاء أثر Esc(1-21) و Esc(1-21)-1 ج من حيث نشاط الهجرة الخلية التي يسببها في الخلايا الظهارية الشعب الهوائية معربا عن CFTR الوظيفية. ووضعت في هذا التحليل، إدراج الثقافة في آبار صفيحة 12-جيدا، وكل حجرة وكان المصنف مع خلايا 35,000 في ميمج وتستكمل مع 10% FBS. الخلايا التوصل إلى التقاء كاملة داخل 24 h. بعد ذلك، ولدت فجوة 500 ميكرومتر، وبعضها أيضا كانت مليئة ميمج التي تحتوي على الببتيد بتركيزات مختلفة. وتكررت هذه التجربة أربع مرات. وكما هو مبين في
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الهجرة الخلية عملية أساسية في العديد من الأحداث الفسيولوجية والمرضية بما في ذلك التئام الجروح، التطور الجنيني، وسرطان خبيث. ويشمل الإجراء الأساسي لدراسة الخلية الهجرة في المختبر : (ط) إنشاء خلية أحادي الطبقة، (ثانيا) إنتاج الجرح الزائفة في الطبقة المتلاقية للخلايا، يتم التوصل إلى الإغلاق (الثالث) التقاط الصور في فترات زمنية مختلفة حتى الجرح ، و (رابعا) تحليل تسلسل الصور من أجل قياس سرعة الهجرة من الخلايا المختارة.
النتائج التي توصلنا إليها أظهرت أن تطبيق إدراج ثقافة موضوعية وموثوق بها.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن
شكر وتقدير
هذا العمل كانت مدعومة بتمويل من مؤسسة البحوث التليف الكيسي الإيطالية (مشروع تقصي الحقائق والتوفيق #11/2014 اعتمدته "الوفود تقصي الحقائق والتوفيق" من سيينا، فالتشيافينا سوندريو، سيارا إيل Sorriso دي جيني وبافيا) وجامعة سابينزا في روما. كما أيد جزءا من هذا العمل قبل فيلاس منحة سلطته فيلاس-رو-2014-1020.
ونحن ممتنون للدكتور لوريتا فيريرا (تم U.O.C. Medica، معهد جيانينا جاسليني، جنوا، إيطاليا) لتوفير الخلايا الظهارية الشعب الهوائية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) | Euroclone | ECB2071L | دافئ في 37 درجة. C حمام مائي قبل الاستخدام |
| الجلوتامين | Euroclone | ECB3000D | |
| مصل الأبقار الجنيني المعطل بالحرارة (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| البنسلين والستربتومايسين | Euroclone | ECB3001D | |
| بوروميسين | سيجما-ألدريتش | P8833 | |
| التربسين / EDTA 1X في PBS | Euroclone | ECB3052D | يسخن في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام |
| DPBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم (CMF-PBS) سيجما | ألدريتش | D8537 | |
| DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم (PBS) | سيجما ألدريتش | D8662 | |
| ثقافة أبيدي - إدراج 2 بئر | Ibidi ؛ | 80209 | |
| Wimasis تحليل الصور | نفس المصدر | 30002 | |
| برنامج PRISM | الإصدار 6.0 | من GraphPad |
المراجع
- Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).
- Kujath, P., Kujath, C. Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens? Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
