Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

بروتوكول التمايز الدماغ 3D مبسطة مع التعديل 2D اختياري

Published: December 9, 2017 doi: 10.3791/56888
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Pediatrics/Child Neurology, Amsterdam Neuroscience, VU University Medical Center, 2Department of Complex Trait Genetics, Center for Neurogenomics and Cognitive Research, Amsterdam Neuroscience, Vrije Universiteit Amsterdam

Summary

ونحن تصف متوسطة بروتوكول هبسكس، باستخدام تعريف تمايز 3D مبسطة وتخفيض عوامل النمو، قادرة على توليد المجاميع الخلية مع أوائل نيوروبيثيليال الهياكل وإيجابية بالنسبة لعلامات مرتبطة بالدماغ، فضلا عن اختياري 2D التعديل للتفريق بين الخلايا كأحادي الطبقة لتوليد الخلايا العصبية الوظيفية.

Abstract

الحد من التعقيد والتكلفة من البروتوكولات التفريق مهم للباحثين. يناسب هذا الاهتمام بالشواغل المتعلقة بالآثار غير المقصودة أن العوامل الخارجية الزخرفة يمكن إدخال الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسك) نماذج نمو الدماغ أو الفيزيولوجيا المرضية، مثل إخفاء المرض النمط الظاهري. وهنا، نقدم البروتوكولين التمايز الدماغ هبسكس، مصممة مع أبسط طريقة لبدء تشغيل، عوامل الزخرفة أقل، وأقل المتطلبات المادية من البروتوكولات السابقة. في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير إجراءات الثقافة، التي تولد التعويم الحر المنتجات ثلاثي الأبعاد (3D) يتفق مع البروتوكولات الأخرى "أورجانويد" في الدماغ، بما في ذلك مورفولوجيس معيني الشكل وذات الصلة للنمذجة نمو الدماغ مثل المنطقة الفرعية/البطين- الهياكل الشبيهة بشفة. والثاني يستخدم إجراء أحادي الطبقة ملتصقة، 2D للتفريق الكامل، الذي يظهر قادرة على توليد الخلايا العصبية الدماغ الوظيفية، منتجات إيجابية للعلامات المرتبطة بالدماغ، ويحمل تدفق الكالسيوم تشبه الخلايا العصبية. معا، هذه البروتوكولات تقدم العلماء خياراً خيارات مناسبة لأغراض بحثية مختلفة، فضلا عن نموذج أساسي لاختبار أنواع أخرى من الاختلاف العصبية مبسطة.

Introduction

البروتوكولات في المختبر للتفرقة بين هبسكس تجاه الأنساب الدماغ في البداية تعمل على مبدأ محاكاة3،2، في فيفو التنمية الدماغ1،4. على هذا النحو، أنها تتطلب سلسلة عوامل التي أدخلت في أوقات محددة محرك الزخرفة برو-الدماغ والنضج. كانت WNT، العظام ومن أهم هذه البروتينات مورفوجينيتيك (BMPs)، وعوامل النمو تنتجها الخلايا الليفية (تعملك) مع أدوار معروفة في منتصف هيندبرين التنمية وتشكيل منظم البرزخية5،،من67. وبطبيعة الحال، كل خطوة إضافية وعامل يعني زيادة في التلاعب كثيفة العمالة وزيادة المصروفات للباحث، وحتى وضع بروتوكولات أبسط قادرة على تحقيق نتائج المساواة من مصلحة. هذه المسألة العملية ممزوج لطيف مع مسألة افتراضية، ما إذا كانت الخلايا تتطلب مثل هذا ضيق، والخارجية السيطرة على التنمية في المختبر.

للتفريق بين الدماغ، موجهة بروتوكول نشر في عام 2015 بضرورة استخدام عدد وافر من عوامل النمو باستخدام فقط FGF2، FGF19، وعامل المستمدة من الخلايا اللحمية 1 (SDF1) لأغراض8الزخرفة. كما تختلف هذه الدراسة البروتوكولات الدماغ السابقة، باستخدام نظام التعويم حر ثقافة 3D. بالإضافة إلى إنتاج الخلايا إيجابية لعلامات الدماغ، والدماغ "أورجانويدس" التي تم إنشاؤها بواسطة التقنية عرضت يحمل مورفولوجيا ذات الصلة، غير متوفرة في ثقافات أحادي الطبقة 2D التقليدية، مثل الهياكل الشبيهة بشفة معيني الشكل. على الرغم من أن أقل تعقيداً وتكلفة فيما يتعلق بعوامل النمو، ميزات أخرى مثل تشكيل الهيئات امبريويد موحدة (EBs) وثقافة في لوحات 96-جيدا (96WPs)، جعلت من الناحية الإجرائية المعقدة خلال الخطوات الأولية. بروتوكول ثلاثي الأبعاد آخر نشر في نفس العام, حسبما ذكرت التمايز ناجحة للأنساب العصبية باستخدام خلية مشتركة وغير مكلفة الثقافة تقنيات9. على الرغم من أن هذا الفريق كان يحقق القشرية بدلاً من التمايز الدماغ، يمكن أن لا تكون مخفضة تطبيق مفهومها للتمايز الدماغ.

أبلغنا مؤخرا بروتوكول تمايز الدماغ ثلاثي الأبعاد باستخدام عدد أقل من العوامل الزخرفة (أي، FGF2، 4 و 8)، فضلا عن إعداد مبسط بإبقاء الخلايا في لوحات 6-جيدا (6WPs) في جميع أنحاء التقليل إلى أدنى حد من متطلبات متوسطة10. مساعدة إنتاج الخلايا الحبيبية، استخدمت مؤثر طرية (تبلد) أثناء الخطوة النضج النهائي. تبلد هو بديل أقل تكلفة المواد كيميائية للقنفذ سونيك (SHH)، التي كانت تستخدم في وقت سابق الدماغ البروتوكولات، نظراً لدورها في تعزيز نمو الحبيبية خلية السلائف (أوتوماتية) في فيفو1،2، 11،،من1213. تمايز المنتجات كانت متسقة مع تلك من بروتوكولات أخرى ثلاثية الأبعاد، بما في ذلك وجود علامات مرتبطة بالدماغ في الهياكل ذات الصلة شكلياً8،9. مثل هذه النتائج تعزيز الرسالة السابقة التي مفصلة تقليد في فيفو البيئة قد لا تكون ضرورية لبروتوكولات معقدة ثلاثية الأبعاد في المختبر التمايز.

ويصف هذا التقرير بالإضافة إلى البروتوكول 3D، بروتوكول ثنائي الأبعاد، مصمم بنفس الإعداد السريع، المواد الأساسية، وخفض عدد من عوامل النمو. هو قادر على إنتاج الخلايا من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسكس) أو بفعل الخلايا الجذعية pluripotent (هيبسكس)، وإيجابية للعلامات المرتبطة بوقت مبكر العصبية، والدماغ، والخلايا الحبيبية الهويات. وباﻹضافة إلى ذلك، تصوير الكالسيوم يدل على وجود الخلايا العصبية البشرية الفنية. القدرة على الاختيار بين البروتوكولات، ويضيف قدرا من المرونة للباحثين، للراغبين في أما: خلية معينة (1) توليد أنواع، ونمو الدماغ البشري (2) النمذجة والهياكل، (3) تحليل الأمثل في أحادي الطبقة المرتبطة إعدادات (مثلاً، تسجيلات المشبك التصحيح)، أو (4)-خلية التفاعلات في الثقافات العصبية مختلطة. طبيعتها بسيطة ومنخفضة التكلفة، يجعل منها موجوداً للباحثين الذين جديدة إلى الميدان هبسك، أو تحتاج إلى إجراءات هبسك قاعدة لاستكشاف المزيد من خيارات التفريق منه.

Protocol

1-الأعمال التحضيرية

ملاحظة: جميع الخطوات انظر الجدول للمواد لبنود محددة.

  1. إعداد 500 مل تعريف هبسك الثقافة المتوسطة للثقافة هبسك
    ملاحظة: استخدم المتوسطة للخطوات 2.1-2.6.
    1. ذوبان الجليد هبسك المتوسطة الملحق بين عشية وضحاها (o/n) في 4 درجات مئوية. إزالة 12.5 مل متوسطة قاعدة هبسك من زجاجة متوسطة، ثم أضف 10 مل من الملحق و 2.5 مل (صنع 100 U/L) البنسلين/ستربتوميسين (القلم/بكتيريا) للزجاجة.
    2. تخزين في 4 درجات مئوية، وتستخدم في غضون أسابيع 2.
      ملاحظة: يمكن استخدام المتوسط هبسك تجميد أسفل الخلايا بإضافة 10 ميكرون روك المانع (RI) و 10% [دمس].
  2. إعداد 1 L صيانة العصبية المتوسطة (نم) للتمييز بين الثقافة
    ملاحظة: استخدم المتوسطة للخطوات 3.1-4.4.
    1. مزيج الجلوتامين المحصنة DMEM/F12 والعصبية المتوسطة الأساسية (نسبة 1:1) في ل 1 زجاجة، ثم الملحق مع الملحق N2 (س 1)، (س 1) الملحق B27، 5 ميكروغرام/مل الأنسولين، 1.5 مم ل الجلوتامين، 100 ميكرومتر الأحماض الأمينية غير الأساسية (نيا)، 100 القلم U/L/بكتيريا، و 10 ميكرومتر بيتا-ميركابتوثانول.
    2. تخزين المتوسطة عند 4 درجة مئوية، وتستخدم في غضون 3 أسابيع.
      ملاحظة: قبل إضافة المكملات الغذائية لمتوسطة القاعدية مختلطة، إزالة وحدة التخزين المناسبة لضبط وحدة التخزين المطلوبة لإضافة مكونات استناداً إلى التركيزات الأسهم.
  3. إعداد 500 مل من 0.5 مم يدتا العامل حل باساجينج هبسكس
    ملاحظة: استخدم المتوسطة للخطوات 2.4 و 2.5.
    1. تحت غطاء تدفق، نقل 49 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) من زجاجة PBS عقيمة 500 مل إلى أنبوب 50 مل. إضافة 0.5 مل يدتا م 0.5 و 0.9 غ كلوريد الصوديوم إلى أنبوب 50 مل. المزيج بلطف بحل.
    2. الحل تعقيم عامل تصفية باستخدام 0.22 ميكرومتر تصفية ونقل إلى 500 مل زجاجة PBS العقيمة. تخزين في درجة حرارة الغرفة (RT).
  4. إعداد هبسك لوحات الثقافة للثقافة هبسك
    ملاحظة: استخدام لوحات للخطوات 2.1-2.6.
    1. جعل 50 × حل عملي لطلاء ملتصقة المناسبة هبسك (الهيئة): ذوبان الجليد قنينة من الهيئة س/ن في 4 درجات مئوية. تمييع الهيئة بنسبة 1:1 مع DMEM/F12 ونقل 400 ميليلتر مختبرين في أنابيب 1.5 مل. مخزن 50 س الحل عمل الهيئة في-80 درجة مئوية.
      ملاحظة: (هام) الهيئة يتصلب بسرعة في الرايت، ولهذا من الضروري الاحتفاظ بكافة المكونات (دميم، والأنابيب، إلخ) على الجليد (أو عند 4 درجة مئوية).
    2. ذوبان الجليد أنبوب 50 س الحل عمل الهيئة في 4 درجات مئوية، ثم يضعف x 50 في البرد DMEM/F12. إضافة 750 ميليلتر/جيدا من الهيئة المخفف 6WP. احتضان لوحة على الأقل 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: لوحات الهيئة قد تكون مخزنة لمدة أسبوع واحد في 4 درجة مئوية، بالتفاف اللوحة بعد فترة الحضانة ح 1. لوحة الحارة إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  5. إعداد لوحات لاصقة المضادة (أإ) للتمييز بين الثقافة
    ملاحظة: استخدام لوحات للخطوات 3.1-4.1.
    1. جعل 5 ملغ/مل بولي (ميتاكريليت 2-هيدروكسيثيل) (بولي-هيما) الحل في 95% إيثانول. اهتز o/n في 37 درجة مئوية حتى يتم الحصول على حل واضح. مخزن في الرايت
      ملاحظة: عملية التصفية من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر يمكنك إزالة أونديسولفيد بولي-هيما.
    2. إضافة بولي-هيما للوحة الثقافة بحيث أنه يغطي الجزء السفلي من كل بئر. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة يومين، وتفقد لوحة لضمان تبخر كاملة لطلاء سائل/محدد من الآبار. لوحات AA قد تكون ملفوفة وتخزينها في الرايت
  6. إعداد لوحات بولي-L-أورنيثيني/لامينين (منظمة التحرير الفلسطينية/لام) للتمييز بين الثقافة
    ملاحظة: استخدام لوحات للخطوات 4، 4، 2-4.
    1. معطف المساحة السطحية من الآبار، واستخدام 20 ميكروغرام/مل منظمة التحرير الفلسطينية حله في برنامج تلفزيوني العقيمة. احتضان لوحة o/n عند 37 درجة مئوية. نضح منظمة التحرير الفلسطينية وشطف 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: قد التفاف لوحة محتضنة (اختياري) مع منظمة التحرير الفلسطينية والمخزنة في 4 درجات مئوية حتى حاجة.
    2. معطف المساحات السطحية للآبار المغلفة بمنظمة التحرير الفلسطينية، واستخدام 10 ميكروغرام/مل لام حله في برنامج تلفزيوني العقيمة. احتضانها لمالا يقل عن 2 ح في 37 درجة مئوية أو س/ن في 4 درجات مئوية. إزالة لام وآبار المياه والصرف الصحي x 2-3 مع برنامج تلفزيوني، ثم أضف فورا المتوسطة المناسبة و/أو خلايا.
      ملاحظة: يمكن تخزين في 4 درجات مئوية الحل "إزالة لام" (اختياري) وإعادة استخدامها حتى 2 مرات. (مهمة) عدم السماح للأسطح المغلفة بلام لتجف؛ لمنع هذا فورا إضافة متوسط مناسب أو برنامج تلفزيوني.
       

2-البروتوكول 1: هبسك خالية من تغذية الثقافة

ملاحظة: تم الحصول على هيسكس من منظمة غير تجارية (خط H01، انظر الجدول للمواد). ثلاثة خطوط التحكم هيبسك (hvs51، 60، و 88) تم إنشاؤها بواسطة إعادة برمجة الخلايا الليفية من ثلاثة مرضى البشرية الصحية (الليفية كانت مشتقة من المانحين المجهولين، وغير قابلة للتعريف وذلك يعفي من موافقة مجلس الهجرة واللاجئين)10، 17.

  1. الحفاظ على هبسكس في ثقافة خالية من علبة التغذية بالورق
    1. بعد ذوبان الجليد وتصفيح هبسكس على لوحات الهيئة في المتوسط هبسك (راجع الخطوة 2، 2)، الحفاظ على هبسكس في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2. تحديث المتوسطة هبسك يوميا (راجع الخطوة 2، 3)، ما عدا اليوم بعد ذوبان الجليد أو باساجينج، ودراسة الخلايا تحت المجهر (الأهداف: 2.5x/0.06، 5 x/0.12 Ph0، 10 ×/0.25 Ph1) لمراقبة نمو معدل وتحديد المجالات المحتملة للتمايز (رقم 3 ، اللوحة اليسرى العلوية يظهر المثال التمايز).
    2. ممر هبسكس كل 3-4 أيام، أو الثقافة عندما يصل إلى > التقاء 80%. إذا كان أقل من 5% من الخلايا معرض التمايز، الاستخدام العادي هبسك باساجينج الأسلوب (راجع الخطوة 2.4)، وإلا تستخدم أسلوب لطيف (راجع الخطوة 2، 5). عندما لم تعد هناك حاجة في الثقافة، هبسكس قد تكون مجمدة للتخزين على المدى الطويل (راجع الخطوة 2، 6).
  2. هبسكس ذوبان الجليد في المتوسط هبسك
    1. نقل وحدة التخزين المطلوب من المتوسطة هبسك أنابيب معقمة لعملية ذوبان (أنبوب مل/المبردة 9) واللوحة الهيئة مستعدة استقبال الخلايا المذابة. الملحق المتوسطة في كلا أنابيب مع 10 ميكرون ري.
    2. استرداد في كريوتوبي من مخزن2 LN ومكان مباشرة في حمام مائي (37 درجة مئوية). عندما فقط صغيرة الجليد يبقى كريستال وإزالة من حمام الماء ونقل محتويات الأنبوبة المبردة إلى الأنبوب لجمود عملية (إجمالي حجم 10 مل). الطرد المركزي الأنبوب في 290 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت
    3. استخدام ماصة مصلية لإزالة الهيئة (راجع الخطوة 1، 4) يقصد بها حل من آبار اللوحة الهيئة تتلقى الخلايا، وإضافة هبسك المتوسطة مع 10 ميكرون ري.
      ملاحظة: (هام) دو لا أسبيراتي حل الهيئة مع إبرة شفط، أو أنه قد يصلب وتسد خطوط إلى مضخة فراغ.
    4. إزالة المادة طافية من الأنبوب وريسوسبيند الخلايا في المتوسط هبسك مع 10 ميكرون ري. توزيع الخلايا إلى لوحة الوجهة في نسبة من أنبوب المبردة 1/بئر 6WP. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2، وعدم التحديث المتوسطة لمدة يوم واحد.
      ملاحظة: بدء تشغيل الخلايا عند 5% O2 قد يزيد بقاء الخلية.
  3. تحديث هبسك المتوسطة
    1. الحارة حجم اللازمة هبسك المتوسطة في أنبوب عقيم في الرايت أو في حمام مائي؛ ومن المقترح من 6WP 2 مل/جيدا.
      ملاحظة: (اختياري): بإضافة مبلغ إضافي قدرة هبسك المتوسطة، هبسكس يمكن أن يبقى يوما إضافيا دون تحديث؛ ومع ذلك، لا تسمح هذه أكثر من مرة واحدة في أسبوع.
    2. نضح المتوسطة من الآبار التي تحتوي على هبسكس وإضافة هبسك الطازجة المتوسطة.
    3. الثقافة هبسكس في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
  4. هبسكس مرور في المتوسط هبسك
    1. نقل وحدة التخزين المطلوب من المتوسطة هبسك إلى أنابيب معقمة، لعملية باساجينج وإعداد اللوحة الهيئة التي تتلقى الخلايا باساجيد. الملحق المتوسطة للوحة الوجهة مع 10 ميكرون ري. الحارة الأنابيب المتوسطة في الرايت أو في حمام مائي.
      ملاحظة: إعداد ومناولة سوف تختلف إذا كان استخدام مادة طلاء بديلة من واحد المذكورة في الجدول للمواد.
    2. استخدام ماصة مصلية لإزالة الهيئة (راجع الخطوة 1، 4) يقصد بها حل من آبار اللوحة الهيئة تتلقى الخلايا، وإضافة هبسك المتوسطة مع 10 ميكرون ري.
      ملاحظة: (هام) دو لا أسبيراتي حل الهيئة بشفط إبرة، كما أنه قد يصلب وتسد خطوط إلى مضخة فراغ.
    3. نضح المتوسطة من الآبار مع هبسكس تكون باساجيد وغسل الخلايا مرتين مع 0.5 مم يدتا، ثم إضافة 0.5 مم يدتا واحتضان لمدة 2-5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: 1 مل/بئر 6WP حجم كاف من يدتا للغسيل والحضانة.
    4. تحقق من الآبار تحت المجهر (الأهداف: 2.5x/0.06، 5 x/0.12 Ph0، 10 ×/0.25 Ph1). إذا كانت الخلايا هي بداية لفصل، نضح حل يدتا وتدفق الخلايا الحرة استخدام هبسك المتوسطة.
      ملاحظة: (هام) رعاية لا لإزالة المستعمرات هبسك كله عند يسفط يدتا (عدم الانتظار حتى يتم فصل كل المستعمرات). عدم مسح خلايا أكثر من 5 مرات كهذا قد يضر هبسكس وتؤثر على بلوريبوتينسي. أيضا، لا تدع الخلايا الوقوف في المتوسط هبسك مع منظمة الروتاري الدولية قبل التنظيف الخلايا من الآبار، كما أنها قد تلتزم بإعادة اللوحة.
    5. استناداً إلى تصميم تجريبية (عادة ما تكون متصلة بالتقاء، حجم المستعمرات، ومعدل النمو)، نقل هبسكس إلى الآبار لصفيحة الوجهة باستخدام تقسيم نسبة 1:4-1:16 (أي، 1 حسنا من اللوحة الأصلية إلى 4 آبار للوجهة لوحة). احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2، وعدم التحديث المتوسطة لمدة يوم واحد.
      ملاحظة: تقسيم نسب عالية كما ممكنة لمنع الازدحام وتحسين مظهر مستعمرات 01:16--01:20.
  5. هبسكس مرور باستخدام الأسلوب اللطيف (ز-الأسلوب)
    1. نقل وحدة التخزين المطلوب من المتوسطة هبسك إلى أنابيب معقمة، لعملية باساجينج وإعداد اللوحة الهيئة التي تتلقى الخلايا باساجيد. الملحق المتوسطة للوحة الوجهة مع 10 ميكرون ري. أنابيب المتوسط الدافئة RT، أو في حوض ماء في 37 درجة مئوية.
    2. (راجع الخطوة 1، 4) تنوي استخدام ماصة المصلية لإزالة الهيئة حل من آبار لوحة الهيئة تتلقى الخلايا، وإضافة هبسك المتوسطة مع 10 ميكرون ري.
      ملاحظة: (هام) دو لا أسبيراتي الهيئة مع إبرة شفط، أو أنه قد يصلب وتسد خطوط إلى مضخة فراغ.
    3. نضح المتوسطة من الآبار مع هبسكس تكون باساجيد، وغسل الخلايا باستخدام 0.5 مم يدتا مرتين. أغسل الثانية، انتظر 30 ثانية قبل يسفط يدتا، ثم أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 4-9 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بينما كان ينتظر، إعداد أنبوب عقيمة مع 4 مل من برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: من 6WP 1 مل/جيدا حجم كاف من يدتا للغسيل.
    4. تحقق من الآبار تحت المجهر (الأهداف: 2.5x/0.06، 5 x/0.12 Ph0، 10 ×/0.25 Ph1). إذا بدأت في فصل الخلايا، بعناية اضغط على جانبي لوحة للمساعدة في المستعمرات مجاناً. عندما > 50% مستعمرات حرة عائمة، واستخدام ماصة مصلية 5 مل نقل المستعمرات في 1 مل برنامج تلفزيوني إلى الأنبوب الذي يحتوي على 4 مل برنامج تلفزيوني (لا تريتوراتي).
      ملاحظة: (هام) نظراً لأن الغرض تنظيف هبسك الثقافة، الاختيار لتحديد ما إذا كان التمييز بين الخلايا تظل تعلق على اللوحة. أيضا، فإنه ليس من الضروري مرور جميع المستعمرات في شكل جيد باستخدام هذه العملية، حيث قد يكون خلفها المستعمرات التي لا تزال تعلق.
    5. انتظر 5-10 دقيقة في RT للخلايا لتسوية في الأنبوب (عدم الطرد المركزي). نضح برنامج تلفزيوني من الأنبوب، مع الحرص على عدم إزالة هبسكس تمت تسويتها. ريسوسبيند بعناية الخلايا في المتوسط هبسك (لا تريتوراتي)، ونقل الخلايا إلى لوحة الوجهة باستخدام تقسيم نسبة 1:4-1:16. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2، وعدم التحديث المتوسطة لمدة يوم واحد.
  6. تجميد أسفل هبسكس
    1. اعتماداً على الالتقاء، استخدم 1 جيدا من هبسكس، في 2-3 أيام (كحد أقصى) في الثقافة، لملء قنينات نعد 1-2 للتخزين في LN2.
    2. في نهاية باساجينج (الخطوة 2، 5)، استخدم 500 ميليلتر أو 1 مل من هبسك المتوسطة لنقل الخلايا من 1 جيدا من 6WP إلى قارورة للواسمات 1 أو 2، على التوالي (500 ميليلتر في قنينة). لكل أنبوبة، بإضافة 500 ميليلتر من 2 × تجميد المتوسطة المتوسطة هبسك التي تحتوي على و 20 ميكرومتر ري [دمس] 20%.
      ملاحظة: يمكن نقل الخلايا (اختياري) في 1 × تجميد المتوسطة في 1 مل/القنينة مباشرة.
    3. ضع الأنابيب المبردة في حاوية التبريد (المحتوية على الكحول) قبل تبريده إلى 4 درجات مئوية، ومخزن فورا في-80 درجة مئوية.
    4. في اليوم التالي، نقل الأنابيب المبردة لدبابة2 LN للتخزين على المدى الطويل.

3-بروتوكول 2: 3D "أورجانويد" التمايز

  1. الإعداد للتمايز مع طريقة ز المعدلة من باساجينج من هبسكس
    1. نقل وحدة التخزين المطلوب نم لعدد الآبار الوجهة إلى أنبوب عقيمة. الملحق مع 4 نانوغرام/مل FGF2 و 10 ميكرون ري. الحارة الأنبوب متوسطة RT، أو في حوض ماء في 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: اعتماداً على التقاء الآبار نشأة، هبسكس تتركز أثناء توزيع لوحة الوجهة في 2:1 أو 3:1 نسبة (أيالآبار 2 من لوحة الأصلي 1 جيدا من لوحة الوجهة)، مع زيادة في حجم نهاية 2.5 مل/بئر من 6WP.
    2. نضح المتوسطة من الآبار المحتوية على هبسكس تكون متباينة، وغسل الخلايا باستخدام 0.5 مم يدتا مرتين. أغسل الثانية، انتظر 30 ثانية قبل يسفط يدتا، ثم أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 4-9 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بينما كان ينتظر، إعداد أنبوب عقيمة مع 4 مل من برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: من 6WP 1 مل/جيدا حجم كاف من يدتا للغسيل. (مهمة) فمن الأفضل استخدام هبسكس التي كانت لا تزيد عن 3 أيام في الثقافة بعد مرور الأخير، وممرات على الأقل 1-2 بعد ذوبان الجليد.
    3. تحقق من الآبار تحت المجهر (الأهداف: 2.5x/0.06، 5 x/0.12 Ph0، 10 ×/0.25 Ph1). إذا بدأت في فصل الخلايا، مجاناً الخلايا عن طريق التنصت لطيف على جانبي اللوحة. نقل الخلايا إلى أنبوب يحتوي على 4 مل برنامج تلفزيوني مع ماصة 5 مل.
      ملاحظة: مسح الخفيفة (هام) وتريتوريشن يسمح لتفكيك المستعمرات وجمع الخلايا فضفاضة، ولكن تجاهل الخلايا التي تظل التقيد بها على اللوحة.
    4. يسمح الأنبوب للجلوس لمدة 10 دقيقة في الرايت، لفصل الجاذبية. اختيارياً، الطرد المركزي الخلايا خفيفة (لا تزيد عن 200 س ز على RT، لمدة 5 دقائق) إذا لزم الأمر.
    5. أسبيراتي برنامج تلفزيوني من الأنبوب، مع الحرص على عدم إزالة هبسكس تمت تسويتها، ريسوسبيند الخلايا في نم مع 4 نانوغرام/مل FGF2 و 10 ميكرون منظمة الروتاري الدولية، ومن ثم توزيعه على لوحة AA المغلفة بنسبة 2:1 أو 3:1. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2، وعدم التحديث في المتوسط لمدة 3 أيام، ما لم يطلب ذلك (راجع الخطوة 3.2.1).
      ملاحظة: (اختياري) تسهيلا لنقل الخلايا، إضافة جزء من الثقافة المتوسطة إلى الآبار لصفيحة الوجهة قبل التوزيع، وريسوسبيند الخلايا في حجم أصغر. أيضا، قد الملون هبسكس، وتحسب لتحديد كثافة خلية البداية الدقيق. ومع ذلك، يجب أن يكون حجم النهائي في لوحة الوجهة 2.5 مل/بئر 6WP.
  2. الحفاظ على ثقافة التمايز التعويم الحر في 37 درجة مئوية (5% CO2)
    1. فحص اللوحات كل يوم للتغييرات في الألوان المتوسطة، وتراكم الخلايا الميتة والتثاقل، والانضمام إلى القيعان.
      1. اختياري: تحديث بغض النظر عن جدول التغيير المتوسطة، (بما في ذلك أول 3 أيام لا منعش) المتوسطة إذا أنها تحولت الصفراء، واتبع الإرشادات للمتوسط تغير/تحديث (الخطوة 3، 3). إذا كان يبدو أن غالبية خلايا ميتة، اتبع الإرشادات الخاصة بتغيير/تحديث المتوسط مع فصل الجاذبية (الخطوة 3، 4).
        ملاحظة: تشكيل الحديدية والنمو في الخلية الكبيرة المجاميع من المتوقع، ولكن الخلايا والخلايا المجاميع يمكن أن تتجمع معا إلى جماهير كبيرة ليس بسبب النمو الفردي/انتشار. إذا كان هذا هو لاحظ، جائز تريتوريشن الخفيفة لتفريق الجماهير. إذا كانت الخلايا تبدأ في التمسك بسطح لوحة AA، العائمة محتويات الآبار المتبقية قد يكون نقل مباشرة إلى آبار جديدة أو نقل أثناء عملية التغيير المتوسطة/تحديث. لا تحاول نقل الخلايا التي تنضم إلى اللوحة.
    2. في يوم 3، تغيير المتوسطة إلى نم مع 4 نانوغرام/مل FGF2. قم بتحديث في المتوسط كل يوم.
    3. في يوم 7، تغيير في المتوسط إلى نم مع 1 ميكرومتر حمض الريتينويك (RA)، 100 نانوغرام/مل FGF8B، و 4 نانوغرام/مل FGF2. قم بتحديث في المتوسط كل يوم.
      ملاحظة: RA (هام) حساسة للضوء. حماية را الثقافة عينات من الضوء.
    4. في يوم 14، تغيير في المتوسط إلى نم مع 100 نانوغرام/مل FGF8B، 100 نانوغرام/مل FGF4، و 20 نانوغرام/مل FGF2. قم بتحديث في المتوسط كل يوم.
    5. في يوم 17، تغيير في المتوسط إلى نم مع 100 نانوغرام/مل FGF8B. قم بتحديث في المتوسط كل يوم.
    6. في يوم 21، تغيير المتوسطة إلى نم مع 100 نانوغرام/مل الدماغ عاملاً نيوروتروفيك المشتقة (BDNF) و 10 نانوغرام/مل الدبقية مشتقة نيوروتروفيك عامل (جدنف). قم بتحديث في المتوسط كل يوم.
    7. في يوم 28، تغيير في المتوسط إلى نم مع 100 نانوغرام/مل بدنف و 10 نانوغرام/مل جدنف، 3 نانوغرام/مليلتر تبلد، 100 نانوغرام/مليلتر عامل نيوروتروفيك 3 (NT3)، و 25 مم بوكل. التحديث المتوسط كل يوم.
    8. في اليوم 35، جمع أورجانويدس 3D للتحليل.
  3. تغيير/تحديث متوسطة التمايز للثقافة 3D
    1. نقل حجم نم المطلوبة مع المكونات المناسبة (انظر 3.2.2-3.2.7 خطوات لجدولة عنصر) إلى أنبوب عقيمة. الحارة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
    2. تلميح اللوحة وهزه بلطف حتى الخلايا تسوية الحواف السفلي من الآبار. بعناية إزالة 2 مل متوسطة القديمة باستخدام ماصة مصلية، تجنب إزالة الخلايا، ثم أضف 2 مل متوسطة جديدة. احتضان عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
      ملاحظة: يجب أن يكون حجم (هام) النهاية من 6WP 2.5 مل/جيدا. في حالة حدوث التبخر، لا تقم بإزالة القديمة 2 مل المتوسطة كهذا أن تجف كذلك الثقافات الخلية؛ بدلاً من ذلك، أضف متوسطة إضافية.
  4. تغيير/تحديث متوسطة التمايز مع فصل الجاذبية
    1. نقل وحدة التخزين المطلوب نم مع المكونات المناسبة لأنبوب عقيمة. الحارة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
    2. نقل محتويات الآبار إلى أنبوب عقيمة، والسماح بأنبوب للجلوس لمدة 10 دقيقة في الرايت، لفصل الجاذبية.
    3. استخدام ماصة إزالة المتوسطة القديمة من الأنبوب، ورعاية لا لإزالة استقر الخلايا، ريسوسبيند في نم مع المكونات المناسبة، وثم توزيعها على الآبار الجديدة المغلفة بألف ألف. احتضان عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
      ملاحظة: (اختياري) للراحة، جزء من الثقافة المتوسطة قد تضاف إلى الوجهة الآبار السابقة للتوزيع، مع تمييز الخلايا حراكه في حجم أقل. يجب أن يكون حجم نهاية من 6WP 2.5 مل/جيدا.

4-البروتوكول 3: البديل التفرقة 2D الثقافة

  1. بدء تشغيل والحفاظ على الثقافة باستخدام الخطوات وفقا للقسم 3 لبروتوكول ثلاثي الأبعاد من خلال 12 يوم
    1. اتبع الخطوات 3.1-3.2.3 والمتوسطة تغير/تحديث وفقا للخطوات 3.3 و 3.4.
  2. قم بالتبديل إلى، والحفاظ على الثقافة في 2D أحادي الطبقة
    1. في يوم 13 من التمايز، اتبع الإرشادات الخاصة بتغيير/تحديث المتوسطة مع فصل الجاذبية (الخطوة 3، 4)، توزيع فقط في الخلايا/المجاميع لمنظمة التحرير الفلسطينية/لام المغلفة صفيحة (راجع الخطوة 1، 6) مع نهاية حجم 2.5 مل/جيدا من 6WP.
      ملاحظة: المتوسط قد تستكمل مع 10 ميكرون ري أثناء الطلاء الأولى للمساعدة في الانضمام والبقاء على قيد الحياة للخلايا. (مهمة) من المستصوب موزعة بالتساوي على الخلايا الموجودة في الآبار، تجنبا للكثافة السكانية المنخفضة أو الازدحام على اللوحات، وممر (راجع الخطوة 4، 4) حسب الضرورة. يجب تحديد حجم المفضل لمنظمة التحرير الفلسطينية/لام مغلفة لوحات (أي، 6WP، 12WP، إلخ) تجريبيا، استناداً إلى معدل انتشار لخط الخلية، والغرض من هذا المنتج. تعليمات ستعطى وحدات التخزين ل 6WP، ويمكن تحويلها بالنصف لكل مضاعفة عدد جيدا (أي، 2 مل/حسنا بالنسبة 6WP، 1 مل/جيدا بالنسبة 12WP، و ما إلى ذلك)
    2. في يوم 14، تغيير في المتوسط إلى نم مع 100 نانوغرام/مل FGF8B، 100 نانوغرام/مل FGF4، و 20 نانوغرام/مل FGF2. قم بتحديث في المتوسط كل يوم كما هو موضح في الخطوة 4، 3.
    3. في يوم 17، تغيير في المتوسط إلى نم مع 100 نانوغرام/مل FGF8B. قم بتحديث في المتوسط كل يوم كما هو موضح في الخطوة 4، 3.
    4. في يوم 21، تغيير على المديين المتوسط ونم مع 100 نانوغرام/مل بدنف و 10 نانوغرام/مل جدنف. قم بتحديث في المتوسط كل يوم كما هو موضح في الخطوة 4، 3.
    5. في يوم 28، تغيير في المتوسط إلى نم مع 100 نانوغرام/مل بدنف و 10 نانوغرام/مل جدنف، 3 نانوغرام/ملليلتر تبلد، 100 نانوغرام/مل NT3، و 25 مم بوكل. التحديث المتوسط كل يوم كما هو موضح في الخطوة 4، 3.
    6. في اليوم 35، جمع الخلايا لتحليلها، أو الحفاظ على المتوسط نفسه كخطوة 4.2.5 للثقافة الممتد (المحتملة الحد لم تختبر).
  3. تغيير/تحديث متوسطة التمايز للثقافة 2D
    1. نقل حجم نم المطلوبة مع المكونات المناسبة (انظر 4.2.2-4.2.5 خطوات لجدولة عنصر) إلى أنبوب عقيمة. الحارة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
    2. نضح المتوسطة من الآبار، ثم أضف 2 مل المتوسطة الجديدة. احتضان عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ (اختياري) النهاية وحدة التخزين في 2.5 مل/كذلك من 6WP، باستخدام ماصة إزالة 2 مل متوسطة القديمة وإضافة 2 مل متوسطة جديدة. حجز جزء القديمة قد يقلل المتوسطة في الآبار، ومنع الخلايا من الاتصال الجوي، صدمة للخلايا أثناء خطوات التغيير.
  4. مرور 2D تمايز الثقافة
    1. نقل حجم نم المطلوبة مع المكونات المناسبة (انظر 4.2.2-4.2.5 خطوات لجدولة عنصر) إلى أنابيب معقمة، باساجينج العملية، وكل على حدة، أن تعد منظمة التحرير الفلسطينية/لام المغلفة صفيحة لاستقبال الخلايا باساجيد. الملحق وسيلة للوحة الوجهة مع 10 ميكرون ري. الحارة الأنابيب متوسطة RT، أو في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. لحفظ في المكونات، من الممكن استخدام نم وحدها للغسيل الخلايا أثناء عملية باساجينج.
      ملاحظة: تجارب (هام) إذا كان سيتم استخدام المنتجات في تصوير الكالسيوم، ضمان لخلايا المرور بين 2-6 أيام قبل انتهاء المفاضلة.
    2. نضح المتوسطة من الآبار تكون باساجيد. إضافة 300 ميليلتر/جيدا من عامل الانفصال القائم على التربسين لوحة دوامة (انظر الجدول للمواد)، لتغطية الآبار، ثم إزالة عامل الانفصال فورا.
    3. تسمح لوحة للجلوس لمدة 2 دقيقة في الرايت، ثم ترخي الخلايا عن طريق التنصت على جانبي اللوحة. إضافة 600 ميليلتر/بئر المعرفة التربسين مثبط (وزارة التجارة والصناعة) ونقل الخلايا في وزارة التجارة والصناعة إلى أنبوب عقيمة مع 5 مل نم.
    4. الطرد المركزي الأنبوب في 290 x ز لمدة 15 دقيقة في الرايت أسبيراتي المتوسطة وإضافة آخر 5 مل نم للأنبوب.
    5. الطرد المركزي الأنبوب في 290 x ز لمدة 15 دقيقة في الرايت أسبيراتي المتوسطة وريسوسبيند الخلايا في المتوسط المناسبة التي تحتوي على ري.
    6. توزيع الخلايا الموجودة على لوحة التحرير/لام استخدام تقسيم نسبة 1:1-1:12، اعتماداً على التقاء الأولية، ومعدل الانتشار، وحجم التفاضلية في الأصل للوحة الوجهة، والحفاظ على 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.

Representative Results

نظرة عامة مرئية لانخفاض النمو عامل بروتوكولات التمايز الدماغ في 2D و 3D
ويبين الشكل 1 بالجدول الزمني الشامل للبروتوكولات التمايز الدماغ 2D و 3D، تحديد الوقت للطلاء وعوامل خارجية. التقدم نموذجية هبسكس تمر التمايز الدماغ ثلاثي الأبعاد هو مبين في الشكل 2: مع خط هيس H01 ابتداء المستعمرات في ثقافة خالية من التغذية في اليوم 0 (أعلى يسار الشكل)؛ يخضع تشكيل المجلس التنفيذي بحلول يوم 2 (العلوي الأوسط)؛ تتحول إلى أكبر خلية المجاميع مع التجويف الظاهر بعد التعريفي العصبية مع جمهورية أرمينيا و FGF8 في يوم 14 (أعلى اليمين)؛ تشكيل المجاميع متفاوتة الحجم والشكل في يوم 28 (أدنى اليسار)؛ النامية في التعقيد مع هياكل مختلفة مجموع واحد المبين في يوم 28 (الشرق الأدنى)؛ ومع استمرار التغيرات المورفولوجية للهياكل نفسها في يوم 35 (أسفل اليمين). التقدم نموذجية هبسكس تمر 2D التمايز الدماغ هو مبين في الشكل 3: مع هيس خط H01 كمستعمرات في ثقافة خالية من التغذية في اليوم 0 (الأيمن العلوي من الشكل، مع الدائرة التي تشير إلى منطقة خلايا المتمايزة بين المستعمرات هيس) ; يخضع تشكيل المجلس التنفيذي بحلول يوم 2 (العلوي الأوسط)؛ تتحول إلى أكبر خلية المجاميع مع التجويف الظاهر بعد التعريفي العصبية مع جمهورية أرمينيا و FGF8 في يوم 13 (أعلى اليمين)؛ تنتشر كخلايا ملتصقة بعد الطلاء في يوم 14 (أدنى اليسار)؛ ومن ثم كأحادي الطبقة الخلايا التي تحتوي على مورفولوجيا أكثر نضجاً/مجمع في اليوم 35 تحت منخفض (الشرق الأدنى) وتضخم عالية (أسفل اليمين).

منتجات 3D يحمل علامات وهياكل نيوروبيثيليوم المبكر
الشكل 2 (الصورة اليسرى السفلي) وإظهار الرقم 4 إلى التباين في مورفولوجيا التجميعية 3D ينظر في جميع أنحاء استزراع، نظراً لاختلاف النمو و/أو معدلات النضج، فضلا عن دمج العشوائية أو كسر بعيداً من المجاميع. وعلى الرغم من عدم التجانس، تنتج كل تفرقة المجاميع العارضة أوائل علامات العصبية والخلايا العصبية، بما في ذلك علامة الحبيبية للدماغ ZIC1، كما أشار إيمونوسيتوتشيميستري (المحكمة الجنائية الدولية) تلطيخ في الشكل 5. الأهم من ذلك، الرقم 5 و الرقم 6 تشير إلى أن ثقافة 3D بسيطة، مع تقليل عوامل النمو، قادرة على توليد المجاميع مع الهياكل المعقدة المتصلة بنمو الدماغ مثل نيوروبيثيليوم المبكر والشفة معيني الشكل.

منتجات 2D يحمل علامات الدماغ ونشاط الخلايا العصبية الوظيفية
بينما لا يمكن استنساخ الثقافات 2D الهياكل ثلاثية الأبعاد المعقدة، فقادرة على توليد الخلايا العارضة أوائل علامات العصبية والخلايا العصبية، بما في ذلك الخلايا الحبيبية للدماغ علامة ZIC1، كما هو مبين تلطيخ المحكمة الجنائية الدولية في الشكل 7. تحليل التعبير الجيني عن طريق الرايت-بكر، كما هو مبين في الشكل 8، وتؤيد نتائج المصبوغة المحكمة الجنائية الدولية، على الرغم من وجود علامة الخلايا الحبيبية المبكر ATOH1 متغير بين التجارب وخطوط. تصوير الكالسيوم تتم بسهولة أكثر في 2D الثقافة. كما يتضح في الشكل 9و التكميلي فيديو 1 التكميلي فيديو 2، تظهر الخلايا كهربائياً حفز تدفق الكالسيوم التي نموذجية من أنماط الخلايا العصبية إطلاق النار، مما يوحي بجيل من الخلايا العصبية الوظيفية.

Figure 1
رقم 1: الجدول الزمني للبروتوكول التمايز (بدءاً من اليوم 0 من التمايز). تشير خانات خط متصل إلى عندما تضاف عوامل محددة إلى متوسط الثقافة، وتشير خانات الخط المنقط إلى لوحة-طلاء لتعديل اختياري في 2D. FGF2، يشير السهم إلى الأسفل لتركيزات أقل (4 نانوغرام/مليلتر)، ويشير السهم إلى تركيزات أعلى (20 نانوغرام/ملليلتر). وقد تم تعديل هذا الرقم من هولمز وهاينه10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الصور برايتفيلد ممثل عن البروتوكول 3D- المستعمرات هيس في d0، الحديدية في d2، المجاميع بعد التعريفي d14، ومجاميع مختلفة الحجم ومورفولوجيا (مرقمة 1-5) في d28، تجميع واحد مع ميزات فريدة من نوعها، شخصية (المشار إليها بالحروف –ج) في d28، و تغييرات مرئية في نفس الميزات في d35. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من هولمز وهاينه10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: الصور برايتفيلد ممثل عن البروتوكول 2D. المستعمرات هيس d0، الحديدية في d2، المجاميع بعد التعريفي في d13، بعد تصفيح المجاميع في d14، بعد نضوج في d35 كما رأينا في 5 x التكبير، والتكبير x 20. الدائرة البيضاء في اللوحة اليسرى العلوية يظهر مجال الخلايا المتمايزة بين المستعمرات هيس. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: صور برايتفيلد تظهر متفاوتة الحجم والتعقيد في الثقافة 3D- المجاميع في اليوم (أ) 8 (هيسكس)، و d35 (ب) (هيبسكس). الصورة الأخيرة تتكون من ثلاث صور منفصلة لإظهار الكامل التجميعية. كل المجاميع قد تأثرت بدمج المجاميع أو الخسارة (قطع) هياكل أصغر. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. يتم إعادة نشر هذا الرقم من هولمز وهاينه10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: المحكمة الجنائية الدولية صور المنتجات ثلاثية الأبعاد تظهر علامات ذات الصلة وهياكل- في ثقافة d35، معرض المنتجات ثلاثية الأبعاد: PAX6 (أخضر) و TBR2 (أحمر) من التجويف من العصبية مثل روزيت تشكيل (الصف الأول)؛ DCX (الأخضر) و NeuN (أحمر) تنتشر من منطقة البطين الحافة الخارجية (VZ)-مثل هيكل (الصف الثاني)؛ KIRREL2، علامة المرتبطة نيوروبيثيليوم الدماغ (الثالث للصف، اليسار)؛ والخلايا ZIC1 علامة المقترنة الحبيبية للدماغ (الصف الثالث، حق). أجريت التجربة عدة مرات باستخدام أربعة خطوط هبسك مختلفة: هيس خط H01 (ن = 5)، و hvs88 الخطوط التوجيهية (n = 4)، hvs60 (ن = 3)، و hvs51 (n = 1). تشير الأسهم إلى الشفة معيني الشكل (RL)-مثل الهيكل. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يتم إعادة نشر هذا الرقم من هولمز وهاينه10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: بنية شبيهة بمنطقة البطين واسعة النطاق في المنتج 3D. في ثقافة d35، تجميع المستمدة من هيس الإيجابية PAX6 (الأخضر) والمرتبطة عادة بالخلايا العصبية المبكرة وجدت داخل بطيني (فزس) ومناطق سوبفينتريكولار (سفزس)، في فيفوTBR2 (أحمر). (أعلى) علامات نجمية (*) الجانب قمي من منطقة VZ مثل تشغيل على طول حافة الإجمالية، مع الأقواس تشير إلى عمق/شعبة VZ/إشارات سفزس. (الأوسط) ممزوج إظهار الأجزاء المتناثرة من PAX6 +/TBR2-الخلايا زيادة في حجم تجاه الطرف الأيمن العلوي من VZ. (أسفل) صورة التكبير أعلى المقطع أشارت إلى مستطيل في وسط الفريق. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من هولمز وهاينه10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: صور غرفة التجارة الدولية للمنتجات 2D إظهار علامات ذات الصلة- في ثقافة d35، معرض المنتجات 2D، هيسكس (الصف العلوي) وهيبسكس (الصف السفلي)، الخلايا إيجابية بالنسبة: علامة خلية الحبيبية ZIC1 والمهاجرة العصبية الدماغ علامة TAG1 (العمود الأيمن)؛ وعلامة العصبية نيوروفيلامينت (NF) و TAG1 (العمود الأيمن). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8: RT-PCR في 2D المنتجات. تحليل التعبير مرناً لخط هيس H01 (الصف العلوي) وهيبسك خط hvs60 (الصف السفلي) في نهاية 2D يوضح البروتوكول المنتجات مع التفريد جل ل: الحبيبية علامة خلية ZIC1، علامة خلية الحبيبية ATOH1، والهجرة العصبية الدماغ علامة TAG1، بوركنجي علامة كالبيندين (كالب)، قناة الكالسيوم تعتمد على الجهد CACNA1A من خلية (ج-1A)، CACNA1E (ج-1E)، مستقبلات حمض غاما – أمينوبوتيريك (GABA) ب 1 (ز-Br1)، والتدبير المنزلي الجين EIF4G2).

Figure 9
الشكل 9: تصوير الكالسيوم/تحليل منتجات 2D. في ثقافة d35، سجلت هبسك تمايز المنتجات لمدة 2 دقيقة تحت المجهر، بعد الحضانة مع صبغة fluor5. في 30 ثانية، حفز الخلايا كهربائياً لمدة 10 s في 10 هرتز-(أ) لا تزال صور هيسكس تظهر في 0 s (يسار) وبعد بدء التحفيز الكهربائي في 30 s (يمين). تشير الأسهم إلى المنطقة للفائدة (ROI) لتحليل تدفق الكالسيوم. (ب) تحليل رسومي يظهر التغيير في الأسفار النسبي مقابل الوقت للعائد على الاستثمار (تغيير في الأسفار = &/F (F-F0)0, حيث و0 = (∑F1-n)/n)، مع طفرات مثل الخلايا العصبية التي تحدث قبل وأثناء وبعد التحفيز. شريط أسود يشير إلى طول التحفيز الكهربائي. مقياس بار (أبيض) = 50 ميكرومتر. كامل التسجيل لهيس (كما يتضح هنا) وخط هيبسك (غير معروضة) توجد في التكميلي فيديو 1 و 2 الفيديو التكميلية، على التوالي. تسجيلات في شكل أفي، سرعة 4 x. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

1 الفيديو التكميلي: الكالسيوم التصوير الفيديو في 2D المنتج من سطر هيس H01. في ثقافة d35، صبغ تمايز المنتجات من خط هيس H01 سجلت لمدة 2 دقيقة تحت المجهر، بعد الحضانة مع fluor5. في 30 ثانية، حفز الخلايا كهربائياً لمدة 10 s في 10 هرتز-التسجيلات المحرز في إطارات 2/s، ومعالجتها إلى فيديو AVI ~ 7 إطارات في الثانية، إنتاج شريط فيديو دائم ~ 30 ثانية، سرعة ~ 4 x. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

2 الفيديو التكميلي: الكالسيوم التصوير الفيديو في 2D المنتج من هيبسك خط hvs51- في ثقافة d35، سجلت تمايز المنتجات من هيبسك خط hvs51 لمدة 2 دقيقة تحت المجهر، بعد الحضانة مع صبغة fluor5. في 30 ثانية، حفز الخلايا كهربائياً لمدة 10 s في 10 هرتز-التسجيلات المحرز في إطارات 2/s، ومعالجتها إلى فيديو AVI ~ 7 إطارات في الثانية، إنتاج شريط فيديو دائم ~ 30 ثانية، سرعة ~ 4 x. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

التعقيدات والتكاليف هي من العوامل ذات الصلة للباحثين الخلايا الجذعية عند اختيار أو وضع بروتوكولات التمايز. وهذا ينطبق بشكل خاص حيث أنها مسألة مفتوحة لمقدار التحكم الخارجي مطلوب لتوليد أنواع الخلايا المطلوب، أو – أنها تشكل بطريقة مختلفة – كيف هبسكس المختصة في إنتاج البيئة الإنمائية الخاصة بها، إذا ما تركت لنفسها كافية، مع المواد الغذائية. الأخذ بعوامل خارجية في المختبر جيد جداً قد تنتج منتجات الخلايا المطلوب، ولكن أيضا يمكن أن تتداخل مع القدرات التنموية الذاتية أن أظهرت الخلايا في الجسم الحي. هذه الاعتبارات هامة، لا سيما إذا كان الهدف استخدام إيبسكس المستمدة من المريض للنمذجة المرض. الاستخدام الواسع النطاق للزخرفة و/أو عوامل النمو يمكن أن تخفي تعمل المرض. البروتوكولات بالتفصيل في هذا التقرير اتبع هذا اتجاه الدراسات السابقة للحد من التعقيد والتكلفة، و/أو استخدام الزخرفة الخارجية عوامل8،9.

استناداً إلى النتائج التي أبلغت عنها موجوروما et al., ودراستنا الأخيرة، يبدو أنه من الممكن تحقيق التمايز تجاه مصائر الدماغ دون بذل جهود متضافرة لاستنساخها في فيفو الظروف، كما قامت بدراسات سابقة 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10-الجزء مثيرة للاهتمام أن الدراستين تستخدم مجموعات مختلفة من عوامل النمو، مما يوحي بأن أي مجموعة من الضروري، على الرغم من استخدام كل من FGF2. هربنا اختبارات إضافية، فيها تتعامل بشكل انتقائي مستبعدة من البروتوكول، وبينت أن الخلايا قادرة على توليد نفس المنتجات دون اقتراحاتك الخارجية10. الفروق بين الدراسات لدينا مؤهلة بحقيقة أن استخدمنا خطوط هبسك مختلفة وأساليب الثقافة، الناجم عن تمايز العصبية مع جمهورية أرمينيا، وتشتمل على عناصر لدعم بقاء الخلايا الحبيبية والنضج (بدنف، جدنف وتبلد وبوكل)11 –14. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت أسلوب بدء تشغيل أقل تعقيداً، بالمقارنة مع موجوروما et al.. وبدأ على البروتوكول بتوليد الحديدية موحدة في 96WPs، الذي معزولة لهم جسديا وكيميائيا عن بعضها البعض. وكان البروتوكول هنا كافة PSCs نسبيا مزدحمة معا في 6WPs أثناء تكوين المجلس التنفيذي، والتي سمحت لهم بالتفاعل بحرية. كيف هذا خلطات أثرت على البيئة الفيزيائية والكيميائية الحديدية وأورجانويدس فيما بعد (بما في ذلك إنتاج الجوهرية مما يشير إلى مركبات) غير معروف، ويمكن استكشافها. أيضا، في حين أننا إظهار التعبير عن الجينات المرتبطة ب — وتوحي بذلك – الأصل الدماغ، تقع داخل هياكل شكلياً مشابهة لتلك التي أوردها موجوروما et al.، لا يمكننا أن نستبعد جيل من الخلايا العصبية تشبه الهياكل التي هي الهوية غير الدماغ. الدراسات المستقبلية، استخدام لوحة كبيرة من الأجسام المضادة مثل تلك التي أوردها موجوروما et al. (أي، ATOH1، كالب، إلخ) من شأنه أن يجعل هذه الإحالات، والمقارنة بين المنتجات لكلا البروتوكولين، أكثر حسما.

ضمن البروتوكول ثلاثية الأبعاد، ومن المهم البدء والاحتفاظ بعدد كاف من الخلايا في الثقافة لضمان إعداد كافية من المنتجات النهائية للتحليل. نظراً ليموت قبالة كبيرة مبكرا في البروتوكول، نوصي بدءاً بأكثر من 500 بئر الحديدية/خلال أول 3 أيام في الثقافة (الشكل 1). هذا لا ينبغي أن صعوبة تحقيق أحجام مستعمرة المعطى هبسكس في ثقافة خالية من علبة التغذية بالورق، ولكن قد لا يكون سهلاً لتلك التي لا تزال تستخدم أساليب تعتمد على التغذية. ونظرا للعدد الكبير من الخلايا، من المهم أن يشاهد لتغيير اللون في المتوسطة (التي تشير إلى تغيرات درجة الحموضة)، وتراكم الخلايا الميتة. ويجب تصحيح على حد سواء لمنع انهيار ثقافة. قد يكون هناك أيضا التثاقل من الخلايا والمجاميع في الهياكل الضخمة. على الرغم من أنه قد لا يزال إلى المجاميع التي يمكن تحليلها، كمية المنتج إلى حد كبير يخفض، حتى كسر منهم إلى مجاميع أصغر مع لطيف تريتوريشن يمكن أن تكون مفيدة. ومع ذلك، تجنب الخلطات طبيعية مثيرة للقلق، هي نفسها يمكن أن تنمو إلى أحجام كبيرة (الشكل 4). إذا أصبحت المجاميع قليلة جداً، فمن المستحسن للجمع بين الآبار بحيث لا تكون المجاميع معزولة تماما. تقلب المنتج (في عدد وحجم ومورفولوجيا) قضية معروفة في الثقافة خلية ثلاثية الأبعاد، بما في ذلك تلك البروتوكولات بدءاً من خطوات تشكيل المجلس التنفيذي معزولة، موحدة، مما يوحي بأن إجراء بدء تشغيل أقل تعقيداً (مثل بروتوكول الموصوفة هنا ) يمكن أن تكون العملية أكثر8،15. بينما هذا التغاير هو شيء الباحثين بحاجة إلى أن نضع في اعتبارنا، لا سيما أثناء التحليل، المبلغ عنها البروتوكول إنشاء المنتجات بما يتفق مع تلك التي وجدت في الأخرى البروتوكولات 3D8،،من915. استناداً إلى حجم ومورفولوجيا، أنها تقع ضمن نطاق روزيت العصبية الدماغية أورجانويد، كما هو موضح في استعراض أجرى مؤخرا من كيلفى وجامعة لانكستر15، مع الأكثر من المناسب تصنيف كروي. ملحوظة خاصة، هي وجود هياكل ثلاثية الأبعاد توحي بمأخذ العصبية مع التجويف ومناطق البطين (الفرعية) ومعيني الشكل الشفة مثل ميزات (الشكل 5 و الشكل 6) كما حددتها جماعات أخرى8 , 15 , 16 , 17-حيث تنتج كل تجربة واحدة على الأقل التجميعية مع المفترضة VZ/سفزس وعلامات مرتبطة بالدماغ (ZIC1، KIRREL2)، تلك معايير مفيدة لتحديد نجاح التفريق 3D استخدام لدينا البروتوكول، مع مثل RL ميزات توفير دعم إضافي. تمديد طول ثقافة الماضي 35 يوما كان لم تختبر، ولكن يمكن اتباعها لتحديد أقصى حد من النمو والتعقيد، والنضج يسمح بهذا الأسلوب.

يستخدم بروتوكول ثنائي الأبعاد بنفس تشكيل المجلس التنفيذي غير ملتصقة وعملية الاستقراء العصبية كبروتوكول ثلاثي الأبعاد وحتى تنطبق أيضا التعليقات الواردة أعلاه. وبمجرد مطلي، ينبغي النظر في مجموعة مختلفة من الاعتبارات. الحديدية ينبغي أن يتقيد بسرعة للخلايا تنتشر إلى الخارج على اللوحة. إذا كانت هناك مشاكل مع الالتزام، بالإضافة لري (إذا لم تكن قد استخدمت)، خفض حجم متوسط، أو قد يتم تطبيق تغييرات تجريبية في تركيز منظمة التحرير الفلسطينية/لام. من المهم أن تبقى الخلايا من زراعة كثيفة أو قليلة جداً (يفضل أن تكون نمت بين 20-80% كونفلوينسي) في الآبار؛ الرصد اليومي وباساجينج في الوقت المناسب من المهم تجنب الخلايا كونفلوينسي أكثر أو عائمة. خلافا للبروتوكول ثلاثي الأبعاد، لا ينبغي يموت قبالة كبيرة خلال الثقافة، على الرغم من أنه قد تكون هناك مناطق ضعف النمو، أو تباطؤ معدلات انتشار. باساجينج يؤثر على حالة نضوج الخلايا (على سبيل المثال، إزالة عمليات الخلية والشبكات المتقدمة بين الخلايا) وينبغي أن يوضع في الاعتبار عند الاقتراب من النقاط حيث سيتم جمع الخلايا أو تحليلها على نحو ما. على سبيل المثال، للكالسيوم التصوير فإنه من المهم جداً خلايا المرور بين 2-6 أيام قبل التحليل. باساجينج قريبة جداً من التحليل قد يعني الخلايا لم يتح الوقت للاتصال و/أو ناضجة، وبعيدا جداً قد تؤدي إلى خلايا الاكتظاظ، مما يجعل التصوير صعباً. على الرغم من أن قد يوجد تباين بين التجارب، نتائج تتسق مع تلك التي أبلغ عنها في البروتوكولات الدماغ الأولية في 2D1،2. تحليل التعبير تلطيخ والجينات في المحكمة الجنائية الدولية تؤكد وجود خلايا إيجابية بالنسبة لعلامة خلية الحبيبية ZIC1، بينما أيضا تحديد علامات المرتبطة مع الهويات الأخرى العصبية والدماغ (الشكل 7 و الشكل 8). تصوير الكالسيوم، الذي ينطوي على التحفيز الكهربائي للخلايا المحتضنة مع صبغة fluor5، أشارت إلى نشاط الخلايا العصبية الوظيفية (الشكل 9و تكميلية الرقم 1، و الإضافي رقم 2)، على الرغم من أنه لم يتم تأكيد إذا كانت هذه وكانت الخلايا الحبيبية. ويمكن القول أن بإعطاء المزيد من الوقت خلايا ناضجة بتمديد فترة ثقافة الماضي 35 يوما، ينبغي زيادة حجم نشاط الخلايا العصبية الوظيفية. ويمكن استكشاف هذه الإمكانية في المستقبل.

بالإضافة إلى خطوط البحوث المقترحة أعلاه، سيكون من اهتمام لتحديد الاختلافات في الهويات المنتج (كمية ونوعية) بين البروتوكولات 2D و 3D. أهمية اقتراحاتك الخارجية كان لم تختبر في 2D البروتوكول، وسيكون من المفيد أن نعرف إذا كان الافتقار إلى هيكل ثلاثي الأبعاد بعد الطلاء، وحتى مسارات الإشارات المرتبطة بها، أن تجعل الثقافات 2D أكثر أو أقل اعتماداً على تلك الزخرفة أوائل المركبات. أكثر البروتوكولات تجريد لأسفل (مثل، لا جمهورية أرمينيا، بدنف، تبلد) بنفس القدر خطوط معقولة لإجراء مزيد من التحقيقات. وأخيراً، الدراسات المستقبلية قد تستفيد من أدوات البحث الجديدة لأفضل وصف (وتقييم كفاءة توليد) المخططات العصبية الدماغ الخاصة بالإنسان.

مع تحذيرات معينة في الاعتبار، سواء ذكرت يمكن استخدام بروتوكولات للاختلاف الدماغ، مع منتجات ملائمة لأغراض مختلفة. أنها قد تخدم كنقطة انطلاق عملية للباحثين إجراء الدراسات التجريبية واختبار صلاحية خطوط الخلايا لمثل هذا الاختلاف، أو كنموذج أساسي لأنواع أخرى من تمايز العصبية المستهدفة.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

نحن ممتنون جاكوبس جيربرين وبرويكي جورجين لمساعدتها التقنية الخبراء، إلى بريسكا ليفيرينك للمساهمة في توليد وتوصيف لمراقبة اللجنة التوجيهية سطرين، وليزا جاسباروتو لإظهار إجراءاتنا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12+Glutamax Gibco 31331-028 glutamine fortified DMEM/F12
Neurobasal medium Gibco 21103-049 neural basic medium
N2 supplement Gibco 17502-048
B27 supplement Gibco 17504001
Insulin Imgen PT468-B
L-glutamine Gibco 25030-024
Non-essential Amino Acids (NEAA) Gibco 11140-035
beta-mercaptoethanol Gibco 21985-023
Poly-L-Ornithine Sigma P3655
Poly (2-hydroxyethyl methacrylate) Sigma P3932 aka Poly-Hema
Laminin Sigma L2020
E8 medium and supplement Gibco A1517001 hPSC medium and supplement
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Sodium Chloride Sigma S-5886
y-27632 (ROCK inhibitor) SelleckChem S1049-10mg
DMSO Sigma D-2650
Geltrex Gibco A1413302 hPSC-appropriate adherent coating (PAAC)
0,5M EDTA Gibco 15575-020
0.2 um filter VWR 28145-77
1.5 mL Eppendorf tube VWR 525-0130
DMEM/F12 Gibco 21331-020
Ethanol VWR 83804360
Parafilm Sigma PM996 wrap for culture plates
cryotubes ThermoFisher 368632
TrypLE Gibco 12563-029 trypsin-based dissociation agent
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) Gibco R-007-100
FGF-2 Peprotech 100-18B
FGF-4 R&D Systems 100-31
FGF-8B Peprotech 100-25
Retinoic Acid Sigma R2625
Brain Derived Neurotrophic Factor Peprotech 450-02
Glial Derived Neurotrophic Factor Peprotech 450-10
Potassium Chloride Sigma P5405
Neurotrophic Factor 3 Peprotech 450-03
Smoothened Agonist (SAG) Cayman 11914 CAS 912545-86-9
Axiovert 40C microscope Zeiss Brightfield imaging microscope
Axiocam Zeiss Brightfield imaging - image aquisition
Eppendorf Centrifuge 5810 Eppendorf 521-0996 centrifuge for cell culture
PBS (gebufferde natrium oplossing) Braun Medical 3623140
5 ml Serological pipets VWR 612-4950
10 ml Serological pipets VWR 612-4951
6-wells culture plates VWR 734-2323
12-wells culture plates VWR 734-2324
hESCs WiCELL line H01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).
  2. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. , Chapter 1, Unit 1H 5 (2012).
  3. Su, H. L., Muguruma, K., Matsuo-Takasaki, M., Kengaku, M., Watanabe, K., Sasai, Y. Generation of cerebellar neuron precursors from embryonic stem cells. Dev Biol. 290, 287-296 (2006).
  4. Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2997-3002 (2007).
  5. Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain--hindbrain development. Trends Genet. 12, 15-20 (1996).
  6. Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Curr Opin Cell Biol. 12, 736-741 (2000).
  7. Tam, E. W. Y., Benders, M. J. N. L., Heine, V. M. Cerebellar Development-The Impact of Preterm Birth and Comorbidities. Fetal and Neonatal Physiology. , 5th ed, (2017).
  8. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Rep. 10, 537-550 (2015).
  9. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12, 671-678 (2015).
  10. Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6, 402-406 (2017).
  11. Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened. Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).
  12. Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).
  13. Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
  14. Borghesani, P. R., et al. BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells. Development. 129, 1435-1442 (2002).
  15. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).
  16. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).
  17. Englund, C., et al. Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J Neurosci. 25, 247-251 (2005).
  18. Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19, 782-789 (2011).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 130، 3D، أورجانويد، والخلايا الجذعية pluripotent، المخيخ، والخلايا الحبيبية، وقشرة
بروتوكول التمايز الدماغ 3D مبسطة مع التعديل 2D اختياري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holmes, D. B., Heine, V. M.… More

Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification. J. Vis. Exp. (130), e56888, doi:10.3791/56888 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter