本方案描述了如何从新生小鼠或早产儿肠道建立肠类器官培养系统，以及一种高效收集小鼠乳汁的方法。
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本文内容
摘要
摘要
人源小肠类器官源自隐窝，在干细胞微环境中培养时包含所有类型的上皮细胞。建立人源类器官的能力 离体 培养系统对于模拟肠道病理生理过程以及研究特定细胞反应具有重要意义。近年来，来自小鼠和人类的肠类器官已在全球多个实验室中被培养、传代并储存，以供未来使用。该肠类器官平台可用于检测各种治疗手段和药物对肠道不同细胞类型所产生的影响。本文提供了一种建立源自新生小鼠和早产儿小肠的原代干细胞来源的小肠肠类器官的实验方案。此外，该肠类器官培养系统被用于评估物种特异性母乳的作用效果。通过改良的人用吸乳器可高效获取小鼠乳汁，所采集的小鼠乳汁可进一步用于科研实验。本文现展示了表达获取的小鼠、人类及供体母乳对源自新生小鼠或早产儿小肠的肠类器官生长与增殖的影响。
引言
坏死性小肠结肠炎（NEC）是早产儿因胃肠道疾病致死的首要原因，近10%在妊娠29周前出生的婴儿会受到影响1,2,3。约一半的NEC患儿会发展为最严重的形式，其存活率仅为10%至30%4,5。在美国，每年用于治疗NEC患儿的费用估计达20至30亿美元6,7，然而在过去30年中，其存活率和治疗方法均未发生显著改变。NEC的发病机制以肠道损伤和黏膜修复障碍为特征8,9,10,11，但导致炎症反应加剧的信号通路以及逆转炎症的机制仍尚未完全阐明。
对于早产儿，人乳喂养已被证实是预防坏死性小肠结肠炎（NEC）的唯一保护性策略。我们先前的研究表明，人乳通过表皮生长因子受体（EGFR）信号通路抑制肠道上皮中天然免疫受体To....
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方案
本研究中的所有动物实验均经圣路易斯华盛顿大学机构动物护理和使用委员会（方案编号 20160187）或匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会（方案编号 14103918）批准。在获得匹兹堡大学机构审查委员会批准（方案编号 PRO14100537）后，根据匹兹堡大学解剖组织获取指南，通过诚信中介系统从匹兹堡大学健康科学组织库获取妊娠不足 24 周的人类胎儿小肠组织。去标识化的人类母乳或巴氏消毒的捐赠母乳经匹兹堡大学机构审查委员会免除知情同意后获取。
1. 从新生小鼠或早产儿小肠中分离隐窝并建立类肠器官
- 培养基制备
注意：培养基应在隐孢子虫分离前一日于超净工作台内配制。- 配制 1.11 L 培养基。取 1 L 含 4.5 g/L 葡萄糖和 L-谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），加入 110 mL 胎牛血清（FBS）（终浓度 10%）、11 mL 青霉素-链霉素溶液（Penicillin-Streptomycin）（终浓度 1%）和 1.1 mL 无菌胰岛素（终浓度 0.1%）。
- 配制 500 mL PBS-抗生素混合液。取 500 mL 1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）并添加 10% FBS，然后加入 5 mL 庆大霉素（终浓度 1%）、1 mL 两性霉素 B（终浓度 0.2%）和 5 mL 青霉素-链霉素溶液（终浓度 1%）。
- 配制30....
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结果
我们首先试图探究表达的人类母乳或巴氏消毒的捐赠母乳是否对小肠类器官产生影响。事实上，人类母乳和捐赠母乳均促进了新生小鼠（图1A）和早产儿来源类器官的生长（图1B）。
由于人乳可促进小肠类器官的生长，我们进一步探究了人乳是否对早产人源类器官的增殖具有影响。结果表明，与对照组相比，人乳能够促进早产人源类器官的增殖（图2A-B，Ki67，红色染色）。重要的是，与对照组相比，人源供体乳也能促进类器官的增殖，但其促进作用略低于未经巴氏消毒的人乳（图2B-C）。随后，我们检测了早产人源类器官中K.......
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讨论
肠上皮由多种细胞亚型组成，这些细胞亚型负责抵御病原体、维持肠道屏障完整性，并在多种疾病的发病机制中可能受到破坏。尽管动物模型能够模拟疾病的某些方面，但来源于小鼠和人类小肠的类肠体（enteroid）ex vivo 模型为测试不同干预措施的效果提供了一个有效平台。该类肠体模型的意义在于，研究人员能够将来自正常或患病动物及人类的肠道干细胞培养并分化为所有上皮细胞亚型，而这是现有方法所无法实现的。该模型系统可用于研究某些难以在小鼠中直接模拟的人类病原体感染，例如肠道病毒25 或诺如病毒26 等。类肠体模型具有多项优势和应用前景；然而，必须注意确保培养基制备过程中所用试剂以及维持类肠体存活所必需的特定外源性生长因子的一致性。
在类肠器官模型中，多个步骤对于成功生成类肠器官至关重要。为尽量缩短冷缺血时间，应尽快处理组织。若将组织置于4 °C的罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）培养基中，可在组织取材后24小时内进行类肠器官的制备，这为必要时的运输或邮寄提供了便利。在建立类肠器官时，.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
MG 获得美国国立卫生研究院资助项目 K08DK101608 和 R03DK111473、March of Dimes 基金会资助项目编号 5-FY17-79、华盛顿大学与圣路易斯儿童医院儿童发现研究所以及圣路易斯华盛顿大学医学院儿科系的支持。CJL 获得 R01DK104946（项目负责人：Silverman）、华盛顿大学与圣路易斯儿童医院儿童发现研究所的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 含4.5 g/L葡萄糖和L-谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Lonza | 12-604F | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 26140-079 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N（胰岛素） | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS） | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 庆大霉素 | Gibco | 15750-060 | |
| 两性霉素B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA），pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1×高级DMEM/F-12培养基 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES） | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100× N-2补充剂 | Gibco | 17502-048 | |
| 50× B-27补充剂（不含维生素A） | Gibco | 08-0085SA | |
| 100× ROCK抑制剂Y-27632二盐酸盐 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| 重组小鼠Wnt3a蛋白 | R&D Systems | 1324-WN | |
| 小鼠Noggin蛋白 | PeproTech | 250-38 | |
| 重组小鼠R-Spondin 1蛋白 | R&D Systems | 3474-RS | |
| 重组小鼠表皮生长因子（EGF） | PeproTech | 315-09 | |
| 生长因子减少型Matrigel基底膜基质 | Corning | 356231 | |
| 35 × 10 mm细胞培养培养皿 | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24孔细胞培养板 | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48孔细胞培养板 | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8孔Nunc Lab-Tek II腔室载玻片系统 | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL锥形管 | Corning | 352070 | |
| 100 μM无菌细胞滤网 | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM无菌细胞滤网 | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1×磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16%多聚甲醛（PFA） | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 吐温X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| 吐温20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| 正常驴血清（NDS） | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI） | Invitrogen | D1306 | |
| 显微镜盖玻片 | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Leica TCS SP8 X共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5英寸针头 | Becton Dickinson | 305196 | |
| 异氟烷 | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| 催产素 | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| 人用双侧电动吸奶器 | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL圆底试管 | Corning | 352058 | |
| 橡胶塞 | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67抗体 | Abcam | AB15580 | |
| 人Mki67引物 F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
参考文献
- Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence? Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
- Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts i....
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重印与许可
