פרוטוקולים חדשים מתוארים כאן כדי לבודד ולאפיין microparticles נגזר מן האדם ואת העכבר נויטרופילים. פרוטוקולים אלה לנצל ultracentrifugation, מיכשור וטכניקות immunoblotting לנתח תוכן microparticle, הם יכולים לשמש כדי ללמוד את התפקיד של microparticles נגזר סוגי תאים שונים של תפקוד התאים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד ואפיון של נויטרופילים, נגזר Microparticles ללימודי פונקציונלי
במאמר זה
סיכום
תקציר
אורך חייהם נויטרופילים, נגזר microparticles (נויטרופיל)-MPs) הם ליפידית, כדורית שלפוחיות זעירות בגודל הנע בין 50 – 1,000 nm בקוטר. MPs הם מתפתחים עתה, חלק חשוב של מכונות איתות ותקשורת לתא. בגלל גודלם מהות שחרורם, עד לאחרונה MP קיומו היה להתעלם. עם זאת, עם טכנולוגיה משופרת, שיטות אנליטיות תפקידם על בריאות ומחלה עכשיו מתגלה. הפרוטוקולים המובאת כאן מכוונים בידוד ואפיון נויטרופיל-MPs cytometry זרימה ו immunoblotting. יתר על כן, מקבלים מספר דוגמאות ליישום. פרוטוקולים אלה לבידוד MP הן מהר, בעלות נמוכה, אינם דורשים שימוש ערכות יקר. יתר על כן, הן מאפשרות עבור תיוג של MPs בעקבות בידוד, כמו גם תיוג מראש של תאי המקור לפני שחרור MP, באמצעות הפלורסנט ממברנה ספציפי עבור הדמיה וניתוח על ידי cytometry זרימה. שיטות אלה, אולם, יש מספר מגבלות כולל טוהר PMNs ו MPs והצורך מכשור אנליטי מתוחכם. Cytometer זרימה באיכות גבוהה יש צורך לנתח MPs ולמזער קריאות חיובי כוזב עקב רעש או אוטומטי-זריחה באופן אמין. הפרוטוקולים שתואר יכול לשמש כדי לבודד ולהגדיר להן MP, לאפיין שלהם סמנים, וריאציה בהרכב בתנאים שונים מגרה. גודל הטרוגניות אפשר לנצל את זה כדי לחקור אם התוכן של קרום חלקיקים נגד exosomes הוא שונה, בין אם הם למלא תפקידים שונים בתוך רקמת הומאוסטזיס לבסוף, ניתן לסייר הבאים בידוד ואפיון של חברי פרלמנט, תפקידם בתגובות הסלולר מודלים מחלות שונות (לרבות, נויטרופיל-הקשורים הפרעות דלקתיות, כמו במחלות מעי דלקתיות או פציעה ריאות חריפה).
מבוא
לאחרונה, "microparticles/שלפוחיות זעירות" שמקורם ציטוזול תא או קרום פלזמה הפכו עניין מדעי רב, כפי המתעוררים הנתונים מראים כי מבנים אלה, הנע בין 50-1, 000 nm בקוטר יכול לשאת מידע ביולוגי, לשמש כשיטה קאנונית של התקשורת הסלולארית. החיסון התא-derived MPs ואלה במיוחד המיוצר על ידי נויטרופילים אורך חייהם (PMNs) עניין רב נתן את תפקידה החשוב של PMNs מארח ההגנה1,2, תגובות דלקתיות3ו ריפוי פצע 4. מסקרן, עד כה, דיווחים רבים הראו פונקציות הן הפרו דלקתיים ואנטי דלקתיות של נויטרופיל-MPs5, רומז על הקשר הפוטנציאלי - מחלות-, מינים-, תפקידים ייחודיים של MPs.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל העבודה בעלי חיים אושרה על ידי IACUC מערבי. כל הניסויים הושלמו ב בהתאם ותאימות עם כל הרלוונטיים ההנחיות הרגולטוריות ומוסדיים. עובד תרומת דם, היה הסכמה מדעת שהוצגו, חתמו; בנוסף, בכל המקצועות האדם במחקר זה טופלו בהתאם להנחיות הפדרלי המוסדיות לרווחת האדם.
הערה: השלבים פרוטוקול מפורטים תחת מקטעי המשנה שלהלן: (i) העכבר מח עצם תא בידוד; (ii) נויטרופיל בידוד מ מאתר מח העצם; (iii) נויטרופיל בידוד של דם אנושי; (iv) MP בידוד של נויטרופיל Supernatants (על-ידי Ultracentrifugation); (v) אפיון MPs מאת המערבי סופג; (vi) אפיון MPs מאת Cytometry זרימה; (viii) יישום של MPs מבודד על המחקר פצע ריפוי
1. עכבר מח עצם תא בידוד
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ניתוח cytometric תזרים נציג של MPs היו מבודדים מן האדם, עכבר PMNs מוצגים באיור1. גודל הטרוגניות של נויטרופיל-MPs יכול להיות מוערך על ידי השוואה כדי החרוזים בגודל ידוע, כפי שמוצג באיור 1A, B עבור האדם MPs. הערה, אין הבדל משמעותי בין גודל הטרוגניות נצפו בין העכבר MPs אנושי. באופן דומה, באמצעות cytometry זרימה ולקרוא פלורסצנטיות, ביטוי של חלבונים/s של בחירה על ידי MPs מבודד של העכבר או ממקור אנושי יכול להיקבע. לדוגמ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקולים עבור בידוד ואפיון של נויטרופיל-derived MPs מתוארים תקשורת זו. מספר נקודות קריטיות מפתח חייב להילקח בחשבון להצלחת ההליך. ראשית, PMNs בטח טרי? כן, להשתמש בניסויים בתוך שעתיים של בידוד כדי למנוע הפעלת ספונטנית ו degranulation. כל הטיפול PMNs במהלך בידוד, עד לנקודה של גירוי חייב להתבצע על קרח כדי למנוע הפעלה ו- MP מוקדמת שחרור12. שנית, ultracentrifugation 1 h או יותר מגדיל את pelleting MPs. שלישית, לניתוח על ידי cytometry זרימה, הכלי חייב מכוילת כראוי עם שילוב של חרוזים פלורסנט מוגדרים על-י.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים יש אין ניגוד עניינים כלשהם הקשורים תקשורת זו
תודות
אנחנו אסירי תודה על הסיוע הטכני של ד ר Suchitra חסוי שמנהל את ליבת נורת'ווסטרן פיינברג הספר של רפואה Flow Cytometry מימון סופק על ידי DK101675 (NIH).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| סרום בקר עוברי (מנוטרל בחום) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 יחידות פניצילין / 10,000 מ"ג/מ"ל סטרפטוקוקוק | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| נתרן כלורי | Sigma | S9888 | סטרילי ומסונן דרך 0.1 יחידת סינון מיקרון |
| Histopaque מסונן סטרילי 1077 | Sigma | 10771 | |
| Histopaque מסונן סטרילי 1119 | Sigma | 11191 | צפיפות 1.119 גרם/מ"ל. תמיסה של פוליסוכרוז ו נתרן דיאטריזואט. הביאו לטמפרטורת |
| החדר פוספט חוצץ מלח (PBS) ללא סידן ומגנזיום | Cellgro | 210-40-CV | |
| אתיל אלכוהול (200 הוכחה) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | מדולל 1:2 לספירת כדאיות התאים |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-Human CD11b-APC מצומד | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (קונצטרציה סופית: 1 ומיקרו; גרם/מ"ל) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-אמינואתיל) מלימיד |
| Annexin V מאגר מחייב | Biolegend | 422201 | |
| חרוזי כיול לזרימה ציטומטריה | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | נתרן דיאטריזואט/דקסטרן 500, צפיפות 1.113 גרם/מ"ל | |
| C57BL/6 עכברים | Jackson Labs | ||
| 15 מ"ל צנטריפוגה שפופרות | 430053 | קורנינג | |
| 50 מ"ל צינורות צנטריפוגות | BD Falcon | 352070 | |
| 25 מ"ל פיפטות סרולוגיות | Celltreat | 229225B | |
| 10 מ"ל פיפטות סרולוגיות | Celltreat | 229210B | |
| 5 מ"ל פיפטות סרולוגיות | Celltreat | 229205B | |
| פיפטות פסטר | בז BD | 357575 | |
| 25 גרם x 5/8 אינץ'. מחטים (מחטי החלקה מדויקות) | BD | 305122 | |
| 100 ומיקרו; m מסנני תאים | Celltreat | 229485 | |
| צינורות ואקטיינר | BD | 367251 | |
| <חזק>ציוד | |||
| LSR מוצר מחקר בהזמנה מיוחדת של פורטסה (SORP | ) BD | (SORP) | |
| צנטריפוגה דלי מתנדנדת | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| אולטרה צנטריפוגה | בקמן | (L8-80 M) | |
| מיקרו-צנטריפוגה | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (פרסקו 17) | |
| צנטריפוגת דלי מתנדנדת | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| מלקחיים ביופסיה, 28 ס"מ | Storz | 27071zj | |
| תוכנה | |||
| תמונה J | המכון הלאומי לבריאות | קוד פתוח |
מקורות
- Hickey, M. J., Kubes, P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).
- Kola....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
