설명 하는 프로토콜 건설, 특성화 및 DNA 소스에서 만든 "domainome" 라이브러리 (선택의 대상)에 대 한 선택 수 있습니다. 이것은 다른 기술을 결합 하 여 연구 파이프라인에 의해 달성: 파지 디스플레이, 접이식 기자와 다음 세대 시퀀싱 데이터 분석을 위한 웹 도구.
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방법 논문
위하여-Seq: Domainome 라이브러리 건설, 유효성 검사 및 페이지 표시 및 다음 세대 시퀀싱 선택 프로토콜
이 논문에서
요약
초록
접이식 기자는 쉽게 식별할 수 있는 고기, 항생제 내성, 단백질 또는 임의의 열려있는 독서 프레임을 접는 제대로 융합 될 때 그 접는 및 기능 손상 등으로 단백질. 우리는 어디, 사용 하 여 가장-1 β-lactamase (암 피 실린 저항을 부여 하는 효소) 게놈 규모, 우리 수 선택 잘못 접힌된 단백질 도메인의 컬렉션 어떤 intronless 유전자의 DNA의 코딩 부분에서 전략을 개발 했습니다. 이 접근 방식, 소위 "domainome"에 의해 얻은 단백질 조각 잘 표현 하 고 수용 성, 구조/기능 연구에 대 한 적합 한 그들을 만드는 것입니다.
복제 페이지 디스플레이 시스템에 직접 "domainome"를 표시 함으로써, 우리 그것은 원하는 바인딩 속성 (예를 들어, 다른 단백질 또는 항 체), 특정 단백질 도메인 선택할 수 필수 제공 보였다가 유전자 주석 또는 항 원 확인. 에 대 한 실험 정보
새로운 차세대 시퀀싱 기술 (NGS)를 사용 하 여 선택한 polyclonal 인구에 가장 풍부한 클론의 id는 얻을 수 있습니다. 이러한 이유로 라이브러리 자체의 다양성, 풍부 및 정확한 매핑을 선택한 조각의 각에 완전 한 정보를 제공 하도록 선택 출력 깊은 시퀀싱 분석을 소개 합니다. 여기에 제시 된 프로토콜 라이브러리 건설, 특성화 및 유효성 검사에 대 한 주요 단계를 보여줍니다.
서론
여기, 우리는 높은 처리량 방법 건설과 genic/게놈 시작 소스에서 접힌 및 수용 성 단백질 도메인의 라이브러리의 선택에 대 한 설명. 접근은 세 가지 다른 기술: 파지 디스플레이, 데이터 분석을 위한 접는 기자와 특정 웹 도구 다음 세대 시퀀싱 (NGS)의 사용. 식별 및 새로운 단백질/단백질 도메인의 주석, 알려진된 단백질의 구조 및 기능적 속성의 정의의 특성에 대 한 단백질 기반 연구의 많은 다른 컨텍스트에서 메서드를 사용할 수 있습니다. 단백질 상호 작용 네트워크입니다.
많은 관련 질문은 단백질 기반 연구에 여전히 존재 하 고 최적의 단백질 생산을 위한 방법의 개발은 조사의 여러 분야에 대 한 중요 한 필요. 예를 들어 간결한 하 고 진 핵 게놈1의 수천의 가용성에도 불구 하 고 코딩 된 단백질 및 펩 티 드의 직접 주석으로 상대 proteomes의 해당 지도 아직도 대부분의 유기 체에 대 한 누락 된. 완전 한 proteomes의 카탈로그는 도전 목표 시간 및 자원의 점에서 거 대 한 노력을 요구로 떠오르고 있다. 실험적인 주석에 대 한 황금 표준 남아 모든 오픈 독서 프레임 (ORFs)는 게놈의 소위 "ORFeome" 건물의 복제. 일반적으로 유전자 기능에 알려진된 활동의 관련된 유전자 ....
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프로토콜
1. ORF 라이브러리 (그림 1)의 건설
- 삽입 DNA 준비
-
합성 또는 genomic DNA에서 조각 준비
- 표준 방법26를 사용 하 여 DNA를 추출/정화.
- DNA를 조각화 하 여 쥡니다. 100%에 30 s 펄스와 일반적인 제안 시작으로 표준 sonicator를 사용 하 여 경우 전원 출력.
참고: 파일럿 실험 할 수와 다른 전원 쥡니다 번 DNA 준비에 대 한 최적의 조건을 설정할. 각 테스트 후 agarose 젤 전기 이동 법에 의해 DNA 조각의 크기를 결정 합니다. - 100 bp DNA 사다리 함께 1.5 %agarose 젤에 sonicated DNA를 로드 합니다. 5 V/㎝ 15 분에서 실행 하 고 조각난된 DNA의 얼룩을 포함 하는 젤의 부분을 잘라 짧은 전기 영동을 수행 합니다.
- 열 기반 젤 추출 키트 삽입 DNA를 정화 하 고 UV 분 광 광도 계를 사용 하 여 농도 측정.
참고: 적어도 500 순화 삽입의 ng는 1.3 단계에서 설명한 대로 소화 벡터의 1 µ g와 출혈을이 단계 후에 얻을....
-
합성 또는 genomic DNA에서 조각 준비
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결과
필터링 접근은 그림 1에서 도식화. Intronless DNA의 각 종류를 사용할 수 있습니다. 그림 1A 에서 필터링 접근의 첫 번째 부분 표시 됩니다: agarose 젤에 있는 bioanalyzer 후, 관심의 DNA의 좋은 조각 조각 150-750 bp의 원하는 크기에 길이 분포의 얼룩으로 나타납니다. 얻은 조각난된 DNA의 대표적인 가상 젤 이미지는 주어진 다. 조각 agarose 젤에 로드, 다음 복구는 최종 복구 및 phosphorylated, 고 임의의 DNA 파편의 도서관을 만드는 이전 무딘된 pFILTER 벡터에 복제. 최적의 조건에서 복제 절차의 각 단계를 수행 하는 것이 좋은 품질 도서관 연구에서 DNA의 총 범위를 필요 합니다.
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토론
높은 품질 높은 다양 한 ORFs 필터링 된 도서관의 창조 때문에 파이프라인의 모든 이후 단계에 영향을 미칠 것입니다 전체 절차의 첫 번째 중요 한 단계입니다.
우리의 방법의 중요 한 유리한 기능 (intronless) DNA (cDNA, genomic DNA, PCR 파생 이나 합성 DNA)의 모든 소스 라이브러리 건설에 적합 이다. 고려 되어야 하는 첫 번째 매개 변수는 pFILTER 벡터에 복제 하는 DNA 파편의 길이 게놈 또는 transcriptome, 소위 "domainome"의 도메인의 전체 컬렉션의 표현을 제공 해야 합니다. 우리는 단백질 도메인 성공적으로 복제 될 수 있습니다, 선택 하 고 마지막으로 확인 한 길이 분포에 걸친 150에서 750 bp33,34, DNA 조각에서 시작 이며이 무슨 라인에 보고는 증명 대부분 단백질 도메인 100 aa 길이 보여주는.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품은 이탈리아 교육부 및 대학에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (CP에 2010P3S8BR_002).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Sonopuls 초음파 균질화기 | Bandelin | HD2070 | 또는 동급 |
| 의 GeneRuler, 100 bp Plus, DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | 또는 동급 |
| GeneRuler, 1kb DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | SM0311 | 또는 동급 |
| 분자 생물학, Agarose | BioRad | 161-3102 | 또는 동급 |
| Green Gel Plus | Fisher Molecular Biology | FS-GEL01 | 또는 동급 |
| 6x DNA 로딩 염료 | Thermo Fisher Scientific | R0611 | 또는 동급 |
| QIAquick Gel 추출 키트 | Qiagen | 28704 | 또는 동급 |
| 의 Quick Blunting Kit | New England Biolabs, | E1201S, | |
| NanoDrop 2000, UV-Vis 분광광도계 | , Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| 고용량 cDNA 역전사 키트 | , Thermo Fisher Scientific | 4368813 | |
| Streptavidin Magnetic Beads, | New England Biolabs, | S1420S | 또는 동급의 |
| QIAquick PCR 정제 키트 | Qiagen | 28104 | 또는 동급의 |
| EcoRV | New England Biolabs, | R0195L | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| T4 DNA 리가제 | New England Biolabs | M0202T | |
| 아세트산 나트륨 3M pH5.2 | 일반 실험실 공급 업체 | ||
| 분자 생물학 용 에탄올 | Sigma-Aldrich | E7023 | 또는 동급 |
| DH5aF '박테리아 세포 | Thermo Fisher Scientific | ||
| 0,2 ml 튜브 | 일반 실험실 공급 업체 | ||
| 1,5 ml 튜브 | 일반 실험실 공급 업체 | ||
| 0,1 cm electroporation cuvette | Biosigma | 4905020 | |
| Electroporator 2510 | Eppendorf | ||
| 2x YT 매체 | Sigma-Aldrich | Y1003 | |
| 암피실린 나트륨 염 | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| 클로람페니콜 | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| DreamTaq DNA 중합효소 | Thermo Fisher Scientific | EP0702 | |
| 데옥시뉴클레오티드(dNTP) 용액 혼합물 | New England Biolabs | N0447S | |
| 96웰 열 순환기(가열식 뚜껑 포함) | 일반 실험실 공급업체 | ||
| 150mm 플레이트 | 일반 실험실 공급업체 | ||
| 100mm 플레이트 | 일반 실험실 공급업체 | ||
| 글리세롤 | 시그마-알드리치 | G5516 | |
| BssHII | 뉴잉글랜드 바이오랩스 | R0199L | |
| NheI | 뉴잉글랜드 바이오랩스 | R0131L | |
| QIAprep 스핀 미니프렙 키트 | Qiagen | 27104 | 또는 동등한 |
| M13KO7 헬퍼 파지 | GE 헬스케어 생명과학 | 27-1524-01 | |
| 스트렙토마이세스 카나마이세쿠스의 카나마이신 설페이트 | 시그마-알드리치 | K1377 | |
| 폴리에틸렌 글리콜(PEG) | , 시그마-알드리치 | P5413 | |
| 클로라이드나트륨(NaCl)시 | 그마-알드리치 | S3014 | |
| PBS, 일반 | 실험실 공급업체 | ||
| 면역침전을 위한 다이나비드스 단백질 G | , Thermo Fisher Scientific | 10003D | 또는 동등한 |
| MagnaRack 자기 분리 랙 | Thermo Fisher Scientific | CS15000 | 또는 동등한 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Nonfat Dried milk powder | EuroClone | EMR180500 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems, Fisher Scientific | 7958935001 | |
| AMPure XP 비드 | Agencourt, Beckman Coulter | A63881 | |
| Nextera XT 듀얼 인덱스 프라이머 | Illumina | FC-131-2001 또는 FC-131-2002 또는 FC-131-2003 또는 FC-131-2004 | |
| MiSeq 또는 Hiseq2500 | Illumina | ||
| 분광광체 | Nanodrop | ||
| Agilent 바이오 분석기 또는 TapeStation | Agilent | ||
| Forward PCR 프라이머 | 일반 실험실 공급 업체 | 5 ' TACCTATTGCCTACGGCA GCCGCTGGATTGTTATTACTC 3' | |
| 역 PCR 프라이머 | 일반 실험실 공급 업체 | 5 ' TGGTGATGGTGAGTACTA TCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3' | |
| 일반 실험실 공급업체 | 용 포워드 프라이머 | 5' TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGGCA GCAAGCGGCGCGCATGC 3'; | |
| 일반 실험실 공급업체 | 용 리버스 프라이머 | 5' GTCTCGTGGGCTCGGAGA TGTGTATAAGAGACAGGGG ATTGGTTTGCCGCTAGC 3'; |
참고문헌
- Loman, N. J., Pallen, M. J. Twenty years of bacterial genome sequencing. Nat Rev Microbiol. 13 (12), 787-794 (2015).
- Jones, C. E., Brown, A. L., Baumann, U. Estimating the annotation error rate of curated GO database sequence annotations. BMC Bioinformatics. 8
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