Summary
ونحن تصف تطور نموذج كروي، ثلاثي الأبعاد في المختبر التي تمكننا من اختبار المعيار الحالي لنظم العلاج التجريبي للرأس والعنق الخلايا الحرشفية في خطوط الخلايا، تهدف إلى تقييم العلاج قابلية والمقاومة على الخلايا الأولية من العينات البشرية في المستقبل.
Abstract
خيارات العلاج الحالية للرأس المتكررة والمتقدمة والرقبة الخلايا الحرشفية (HNSCC) أرفق الإشعاع والكيماوي-الإشعاع النهج مع أو بدون عملية جراحية. في حين نظم العلاج الكيميائي على أساس البلاتين حاليا تمثل معيار الذهب من حيث الفعالية، وترد في الغالبية العظمى من الحالات، نظم العلاج الكيميائي الجديدة، إلا وهي العلاج المناعي آخذة في الظهور. ومع ذلك، معدلات الاستجابة والعلاج آليات المقاومة لنظام العلاج الكيماوي أما يصعب التنبؤ وتظل مفهومة غير كاف. اختلافات واسعة من آليات المقاومة الكيماوي والإشعاع معروفة حتى الآن. تصف هذه الدراسة وضع مقايسة موحدة، والفائق في المختبر لتقييم الاستجابة HNSCC الخلية خط لمختلف الأنظمة العلاجية العلاج، ونأمل في الخلايا الأولية من المرضى الفردية كأداة مستقبل للورم شخصية العلاج. المقايسة صمم لإدماجها في خوارزمية مقياس مراقبة الجودة للمرضى هنسكك في مركز الرعاية الثالثية بنا؛ ومع ذلك، سيكون هذا موضوع دراسات المستقبلية. الجدوى التقنية تبدو واعدة للخلايا الأولية من ورم الخزعات من المرضى الفعلية. ثم يتم نقل العينات إلى المختبر. يتم فصل خزعات ميكانيكيا متبوعاً بالهضم الأنزيمي. ثم تستزرع خلايا في قنينات الثقافة خلية التصاق منخفضة للغاية التي تروج لتشكيل تكتلات خلية ثلاثية الأبعاد، على شكل كروي استنساخه وموحدة وعفوية. ثم الماغنيسيوم على استعداد للتعرض للإشعاع الكيماوي البروتوكولات وبروتوكولات العلاج المناعي حسب الحاجة. حجم الخلية النهائية على البقاء وكروي مؤشرات قابلية العلاج ويمكن استخلاص ذلك في الاعتبار في المستقبل لتقييم استجابة المرضى العلاج المحتمل. هذا النموذج يمكن أن يكون أداة قيمة وفعالة من حيث التكلفة نحو شخصية علاج سرطان الرأس والرقبة.
Introduction
الرأس والعنق الخلايا الحرشفية (HNSCC) هو سادس أكثر أنواع السرطان شيوعاً في جميع أنحاء العالم مع حدوث ارتفاع المرضية المرتبطة بالإصابة المخاطية فيروس الورم الحليمي البشري (فيروس الورم الحليمي البشري)، إلى جانب غالبية الحالات الناجمة عن إفراط النيكوتين والكحول الاستهلاك 1،2. بينما عادة علاجها جيدا مع الاستئصال الجراحي، عادة جنبا إلى جنب مع تشريح العقدة الليمفاوية عنق الرحم، أورام أصغر ومراحل ما قبل الغازية علاج هنسكك مرحلة متقدمة والمتكررة لا تزال صعبة بسبب غزو الورم العدوانية مع انتشار المنتشر والمقاومة للإشعاع والعلاج الكيميائي البروتوكولات3،4،،من56،،من78. تشير الدراسات الأخيرة إلى تقلب عالية من النمط الظاهري الخلوية، وتوصيف الفرعية المتمثلة في تعميم ونشر ورم الخلايا قد بدأت للتو9،10. اعتقاد سابق من ورم صلبة وموحدة قد الجماهيري المزمع تنقيحها في ضوء الدراسات التي أجريت مؤخرا في الماضي سنوات11،،من1213،14. النهج الحالي لتوصيف الورم وتحديد الطفرات الرئيسية يمكن تحديد عدد الجينات التي يبدو أنها مرتبطة بمقاومة العلاج، لكنه يظل نهجاً باهظة التكلفة. وعلاوة على ذلك، لا تسمح معرفة التركيب الوراثي تنبؤ موثوق بها من النمط الظاهري وردها العلاج بالضرورة.
وهناك بعض التقدم في تحسين البقاء على قيد الحياة عموما وخالية من الأمراض للمرض مرحلة متقدمة والمتكررة. للنيكوتين-فضلا عن سرطان المرتبطة بالفيروس، أرفق خيارات العلاج الحالية إلى جانب الجراحة الإشعاعية العدوانية ونظم العلاج الكيميائي على أساس البلاتين. وكانت هناك آثار بالنسبة لمعدلات استجابة مختلفة بين سرطان فيروس الورم الحليمي البشري-السلبية والإيجابية؛ ولكن هذا لم يؤدي إلى تغيير وجه عام المبادئ التوجيهية للعلاج. المقاومة تجاه الإشعاع والعلاج الكيميائي هو ظاهرة واسعة انتشار في جميع مراحل الورم ويوجد للبلاتين--على أساس العلاج الكيميائي كذلك أما بالنسبة للعلاج المستهدفة (مكافحة-EGFR؛ مستقبلات عامل نمو البشرة) ومؤخرا بدأت تظهر نقطة تفتيش تثبيط15. يأتي الإشعاع غير فعالة والعلاج الكيميائي بتكلفة عالية كبيرة الاعتلال المرضى من حيث خطر انخفاض وظيفة الكلي أو القلب بينها عسر البلع وجفاف الفم والتهاب الغشاء المخاطي. التنبؤ باستجابة العلاج قبل قرار مفهوم العلاج العام لكل مريض على حدة ويبدو أن الهدف الحاسم، ومنع مفاهيم العلاج لا لزوم لها، والآثار الجانبية والتكاليف.
لقد سعينا إلى إقامة نموذج لاختبار قابلية المعالجة الفردية للمريض نحو الحالية الكيماوي-الإشعاع القياسية التي يمكن إدماجها في الخوارزمية علاج الأورام العادية ومراقبة الجودة من وجهة نظر تقنية دائمة. وكان الهدف الأقصى لاستخدام النموذج دون استخدام خطوط الخلايا المتغيرة بشكل كبير والذين تتراوح أعمارهم بين، كما أنها تمثل ضعف الخلايا السرطانية البشرية الفعلية دون تغيرها وعدم التجانس كما نعلم الآن، أثناء إنشاء بروتوكول جرى في مختلف خطوط الخلايا. أن تكون مستقلة فقط من خطوط الخلايا المتوفرة تجارياً، نحن مؤخرا بنجاح إنشاء خط خلية وسيطة تسمى "البيكا" من الخلايا هنسكك الأولية من عينات الأورام البشرية مع علامات الخلوية يحافظ على الممرات السطحية والمحدودة 16. ينبغي خط الخلية "بيكا هذا" بمثابة تمهيدا لوضع نموذج على الطريق إلى ثم في وقت لاحق عقب محاكمات مع الخلايا السرطانية البشرية الطازجة من ورم الخزعات. وقد ثبت أن الخلايا في خلية ثلاثية الأبعاد تتفاعل الثقافات بشكل مختلف وأكثر في فيفو-تود إدارة عقاقير مضادة للسرطان من تلك التي تنمو في مونولاييرس17،،من1819،20 ،21، أساسا بسبب الحفاظ على الهجرة والتمايز الفرعية خصائص معينة خلية فرعية22،،من2324. هنا، يمكننا وصف البروتوكول لنموذج ثلاثي الأبعاد على أساس كروي من خطوط الخلايا الوسيطة والخلايا الأولية الخلايا الحرشفية البشرية وطرق كيفية دمج هذا نموذج في علاج سرطان الرأس والرقبة الجراح والأورام ( الشكل 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الدراسات التي تظهر في هذه المخطوطة، هي استخدام عينات من الأورام البشرية، محمية تحت وفي موافقة مع القرارات السابقة من الطب من ماينز/جامعة "ميونيخ، الأخلاقيات الطبية على مركز" اللجنة. المرضى قد أعطت الموافقة عن علم وفقا للمبادئ التوجيهية القانونية الوطنية الموافقة على الاستخدام العلمي للفائض من المواد البيولوجية التي تم الحصول عليها أثناء علاجهم. وقد أجريت بحوث امتثالا لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان.
1-أخذ خزعة ورم من الرأس والخلايا الحرشفية هيك
- أداء العام (بروبوفول و/أو سيفوفلوراني، عامل استرخاء العضلات) أو تسلل المحلية (التراكايين 2%، أدرينالين)/سطح التخدير (xylocaine) في كرسي فحص غرفة العمليات أو الحنجرة. تصور كتلة ورم في الفم أجزاء تجويف/البلعوم/الحنجرة/أخرى من الجهاز الهضمي والجهاز التنفسي العلوي مع تشغيل أدوات موحدة، وإذا لزم الأمر، تحت المجهر.
- أخذ خزعة ورم طازجة من محيط الآفة السرطانية بأدوات غير حادة أو قطع. تجنب مركز الآفة سبب نخر الوفيرة في هذا المجال. وضع الأنسجة التي تم الحصول عليها في حاوية معقمة بمحلول كلوريد الصوديوم متساوي التوتر.
- بعد الخزعة، إجراء الأرقاء حسب الحاجة، على سبيل المثال-، مع جهاز تخثر القطبين أو أحادي القطب بالإضافة إلى استخدام المواد فاسوكونستريكتيفي.
- إحضار خزعة الورم يعتزم استخدامها لإجراء التجارب على ثقافة الخلية مباشرة إلى المسالك المختبر مجاورة. إرسال الخزعات الورم الأخرى إلى الطبيب الشرعي كالمعتاد استبعاد السرطان.
- تأكد من أن فني مختبر على استعداد لتجهيز العينة مباشرة.
2-تجهيز العينة الورم
- ضع العينة الورم على سطح مناسب والعقيمة وقطع عليه تماما مع استخدام واحد مشرط معقم أربا بأقل قدر ممكن.
تنبيه: تأكد من موثق توثيقاً جيدا الحالة الأمراض المعدية والمنقولة عن طريق الدم والفني في اهتمام المؤسسات المعيارية بروتوكولات لمنع إبرة عصا أو إصابة القطع مع يحتمل أن تكون واقية من المواد المريض بروتوكولات لمتابعة بعد الإصابة المحتملة. - بعد فصل الميكانيكية كافية من الأنسجة الأولية، وضع الأنسجة في قنينة تحتوي على كولاجيناز أنا/ثانيا واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية. منخل من خلال 70 ميكرومتر صقر خلية مصفاة وتغسل التعليق مع حل هانكس "متوازن الملح" (حبس).
-
بعد فصل ناجحة والغسيل اللاحقة، ضع تعليق يحتوي على 1-2 × 106 خلايا في T75 خلية ثقافة قوارير (75 سم2) ليصل إلى كونفلوينسي الفرعية في 5% CO2 ودرجة الحرارة 37 درجة مئوية. هذه الخطوة قد يستغرق مدة تصل إلى 10 أيام.
- استخدام keratinocyte خاصة الثقافة المتوسطة تتألف مما يلي: 125 مل دولبيكو تعديل النسور المتوسطة (دميم)، 250 مل من Keratinocyte تكمل المتوسطة (المتوسطة يكمل تتألف من 500 مل من المتوسطة سادس Keratinocyte، 15 ملغ للأبقار الغدة النخامية استخراج (بب)، 2.5 مل من البنسلين/ستربتوميسين، 150 نانوغرام المؤتلف طلائي النمو العامل البشري (لو)، ميليلتر 516 من 300 مم كاكل2، مزيج الأسهم لتكون معدّة مسبقاً)، 125 مل مزيج المغذيات F12، 10 ملغ بب (0.75 مل)، 75 نانوغرام الماشوب البشري لو (2 ميليلتر) ، 3.75 مل مم 200 لتر-Alanyl-لجلوتامين-ديبيبتيدي (جدول المواد).
3. بذر الخلايا في لوحات الثقافة خلية التصاق منخفضة للغاية
- تأكيد نمو الخلايا السرطانية تحت مجهر. عد الخلايا في الثقافة (الابتدائي أو خلية ثقافة) والبذور 5,000 الورم الرئيسي الخلايا أو الخلايا 1,000 2,000 خط الخلية المتوسطة/خط الخلية آخر في 200-300 ميليلتر من الوسائط (الخطوة 3.2.) داخل صفيحة التصاق منخفضة للغاية مع محدب، جولة القيعان (96-أيضا).
-
الثقافة الخلايا في 5% CO2 في 37 درجة مئوية وفي أجزاء متساوية دميم ومجرى الهواء الخلايا الظهارية المتوسطة (بيجم)، 10% مصل بقرى الجنين، 1% البنسلين/ستربتوميسين، بيروفات صوديوم 1%، والأحماض الأمينية غير الأساسية 1%، 1% لالجلوتامين (الخطوة 2.3.). إذا كانت تستخدم خطوط الخلايا، وسائل الإعلام على أساس دميم غير كافية.
- إجراء تغييرات في وسائل الإعلام كل يوم. تولي اهتماما لا لنضح كروي مع ماصة أثناء تغييرات الوسائط. الثقافة الماغنيسيوم حتى مستوى النمو كما هو التوصل إلى المشروحة في 3.3 (حوالي 7-10 أيام).
- تأكيد تشكيل كروي عفوية تحت المجهر التي تبحث عن التكتلات خلية ثلاثية الأبعاد، على شكل كروي. استبعاد الآبار مع عدم انتظام و/أو تشكيل كروي متعددة من إجراء مزيد من التحقيقات.
ملاحظة: الماغنيسيوم يجب أن تكون مرئية بالعين المجردة، أيضا، تيسير مواصلة تجهيزها والوسائط التغييرات كما هو موضح أدناه.
4-تعريض الماغنيسيوم لعلاج الورم المتعدد الوسائط القياسية أو التجريبية
- اختيار نظام علاج المطلوب. تصميم مجموعات كبيرة بما فيه الكفاية أن تسمح بإجراء مقارنات لعلاجات الماغنيسيوم غير المعالجة أو الماغنيسيوم تلقي نظم العلاج الجزئي فقط، على سبيل المثال. الإشعاع وحدها. حجم المجموعات التحكم يعتمد على تصميم المجموعة التجريبية ولا يمكن أن يعرف عالمياً.
- تبادل وسائل الإعلام إلى وسائل الإعلام مع إضافات، ووسائط الإعلام معنى بتشريعات و/أو الأجسام المضادة عند التركيزات المطلوبة. إضافة سيسبلاتين في تركيزات 2.5/5/10 ميكرومتر أو 5-فلوروراسيل (5FU) في 30 ميكرومتر.
ملاحظة: لتجارب إنتاجية عالية أو عدد أحجام/كبير مجموعة كبيرة من الفئات، يمكن للمرء استخدام روبوت الآلي بيبيتينج كما نحن كذلك إنشاء في التجارب. - وبدلاً من ذلك، تشع لوحات ثقافة الخلية مع الماغنيسيوم في 2 غراي استخدام مرفق إشعاع مناسبة.
تنبيه: احترام بروتوكولات للمؤسسة فيما يتعلق بالوقاية تعرض للإشعاع الضار للموظفين. يعمل فقط مع الفنيين المعينين والمدربين وفقا للمبادئ التوجيهية للحماية الإشعاعية. إذا رغبت في ذلك، إضافة تشريعات كما هو موضح تحت 4.2. بعد ذلك. - احتضان الخلايا ل 24 ساعة في ظروف الثقافة هو موضح سابقا (37 درجة مئوية، والخطوة 3، 2).
- بعد الحضانة، لا تزال ثقافة الخلية على الأقل 6 أيام مع التغييرات وسائل الإعلام كل يوم.
5-تقييم حجم كروي ومدى انتشار الهاتف الخلوي للقراءة بالانزيم
- قياس حجم كروي من حيث المساحة بعد وثائق الصور الرقمية في يوم 6 (يوم 10، يوم 16) مع برامج رسم (المعلمة 1).
- بعد الطرد المركزي في 520 ز x 2.5 دقيقة اللوحة، إزالة المادة طافية. تغسل في الخلايا التي تحتوي على كمية كافية من 1 × برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي اللوحة مرة أخرى كما هو موضح، يليه إزالة المادة طافية (PBS).
- إضافة 100 ميليلتر من الخلية الانزيمية مفرزة الحل لكل قنينة للسماح الماغنيسيوم حل. احتضان لوحة ل 8 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- البحث عن حل ناجح كروي تحت المجهر. إضافة 100 ميليلتر من دميم. الطرد المركزي اللوحة في ز 520 x 2.5 دقيقة إزالة المادة طافية وتعليق الخلايا في 100 ميليلتر من دميم.
- القيام مقايسة انتشار اللونية متاحة تجارياً، في مقايسة WST-8 مثال على كل قنينة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة25. وقرأ المقايسة في قارئ المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA) (المعلمة 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كنا قادرين على تكاثر توليد الماغنيسيوم من تعليق خلية مفردة، أولاً من خطوط الخلايا المختلفة بما في ذلك خط الخلية بيكا الملكية، في وقت لاحق من الخلايا السرطانية البشرية الأساسية المستمدة من خزعات ورم جديدة كما هو موضح في هاجمان وآخرون . 26-نحن تقييم اثنين من الأساليب المتبعة لجيل كروي؛ إسقاط اثنين يجري معلقة ما يسمى (HD) أسلوب وطريقة التصاق منخفضة للغاية (العلا)، يجري واحد أكثر فعالة وآمنة. كنا قادرين على تسليط الضوء على مزايا الأسلوب العلا عالية الدقة، بما في ذلك نمو أسرع كروي، بالمقارنة مع عدد أقل من القضايا مع لوحة المناولة، وما يترتب عليه من فقدان الماغنيسيوم مع الاهتزازات الثقيلة، ومزيد من النمو كروي استنساخه من حيث الاتساق ( الشكل 2). وكان حدوث الماغنيسيوم متعددة كل قنينة أكثر شيوعاً في أسلوب عالية الدقة. علينا التحقق من وصف أكثر وضوحاً مورفولوجية كروي. ويبين الشكل 3 إيمونوتشيميستري تلطيخ ل Ki67، علامة على انتشار، كروي من الخلايا بيكا. كما هو موضح في الأدب، والماغنيسيوم تتألف من أقل تنتشر الأساسية مع طبقة خارجي المتكاثرة، ومحاكاة مختلف مناطق انتشار HNSCC الصلبة في البشر. في المختبر في فيفو، هذا يرجع يفترض أن تدرج المواد المغذية والأكسجين تم توفيره بواسطة وسائل الإعلام ثقافة خلية مما تسبب في انخفاض من الهامش إلى مركز الورم.
ثم حاولنا أن نظهر أن المقايسة قادراً على الكشف عن الاختلافات في حجم كروي بعد الحضانة مع عقاقير العلاج الكيميائي أو التعرض للإشعاع المؤين، هنا يمثلون اثنين نظم العلاج القياسي الموحد هنسكك. قبل ربما إدماج المقايسة في روتين معالجة مسبقة، سيكون التحقق حساسية المقايسة شرطا أساسيا. معلمتين كانت متاحة كنقاط النهاية للمقايسة: حجم كروي (منطقة؛ والمعلمة 1 من الخطوة 5، 1) وانتشار (انظر المعلمة 2 من الخطوة 5.4.)، يجري علامة بديل لبقاء الخلية وإمكانات النمو بعد العلاج. وترد نتائج دراسات العلاج مع العلاج الكيميائي مشترك وبروتوكولات العلاج الكيماوي-الإشعاع في الشكل 4. التعرض والحضانة الماغنيسيوم مع سيسبلاتين أو 5FU أدى إلى انخفاض كبير في سرعة النمو مع مرور الوقت مقارنة بمجموعة السيطرة غير معالجة (ف< 0.001). الإشعاع مع 2Gy كان قادراً على الحد من سرعة النمو على نحو كبير (ف< 0.01). مقايسة البقاء على قيد الحياة (WST-8) كان قادراً على الكشف عن قيمة إضافية وكبيرة من الإشعاع الكيماوي مع سيسبلاتين مقارنة بالإشعاع وحدة (ف = بين 0.017)، مسبقاً دون أن تكتشف الفرق في تقييم حجم كروي. وهذا يؤكد أهميتها بالنسبة المقايسة ككل، زيادة حساسيتها للتغيرات الصغيرة استجابة العلاج.
رقم 1: مفهوم نموذج في الطريق إلى العلاج شخصية المستقبل- المرضى الذين لديهم أما الخلفية لعدوى فيروس الورم الحليمي البشري المخاطية و/أو تاريخ من تعاطي التبغ والكحول هذا إلى مركز الرعاية الثالثية الإحالة للاشتباه في تشخيص سرطان الرأس والرقبة. وتؤخذ خزعات من المناطق المخاطية المشبوهة أو الجماهير ورم العيانية تحت التخدير لتأمين التشخيص. بالإضافة إلى ذلك، نحن نأخذ ورم الخزعات لتوليد الثقافات الخلية على شكل كروي ثلاثي الأبعاد في المختبر. عند نمو كافية الماغنيسيوم استناداً إلى الخلية الأولية، نحن يعرضهم لنظم العلاج القياسي أو التجريبية الحالية لاختبار استجابة العلاج الفردي. يمكن إضافة تحاليل أخرى من الاختلافات الوراثية أو الجزيئية بعد تحليل نتائج العلاج. ويمكن استخلاص علاج النتائج في المختبر في الاعتبار في عملية التخطيط مفاهيم العلاج بالنسبة للمريض. وهذا الرقم هو طبع من هاجمان، J. et al. 26، مع الإذن الممنوح من قبل المؤلفين ودفتر اليومية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: يمكن أن تولد كل خلية خطوط الماغنيسيوم موثوقة؛ والاختلافات في حجم ووقت القراءة وهي وفقا للشكل 1- في التجارب الأولية والخلايا الأولية لا تشكل الماغنيسيوم استنساخه في هد لكن العلا لوحات (أسفل اليسار). إجراء المزيد من الدراسات التي يتعين الاضطلاع بها لتقييم الخصائص النمو كروي من الخلايا الأولية. عدد الخلايا على اليمين هو العدد الأولى لخلايا وضعت في القنينة شكل كروي. وهذا الرقم هو طبع من هاجمان، J. et al. 26، مع الإذن الممنوح من قبل المؤلفين ودفتر اليومية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: Ki67 immunochemistry تلطيخ شريحة كروي (بيكا)- هامش الثقافة يبين معدلات انتشار أعلى بكثير من الخلايا المركزية، محاكاة توزيع المغذيات في الأورام المخاطية الصلبة التي غالباً ما تظهر النوى نخرية. وهذا الرقم هو طبع من هاجمان، J. et al. 26، مع الإذن الممنوح من قبل المؤلفين ودفتر اليومية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: دراسات العلاج. (أ) كانت بيكا الخلايا المزروعة لتوليد الماغنيسيوم (n = 12 كل مجموعة) في لوحات العلا. حفز الخلايا وفقا للبروتوكول مع أي برنامج تلفزيوني كما التحكم، سيسبلاتين في 5 ميكرومتر أو 5FU في أحجام ميكرومتر. 30 الماغنيسيوم وحددت يوم 6 و 10 و 16 وفقا للبروتوكولات القياسية. المعاملة سيسبلاتين أو 5FU أدى إلى انخفاض كبير في حجم (فيتم إعطاء القيم في أسفل اليسار في الجزء (ب) تصميم تجريبية مماثلة كما هو الحال في (أ) (ن = 12)، ولكن مع إشعاع إضافية من 2Gy. (ج) يظهر المؤامرة دقيقة إلى الحد الأقصى. ووفقا الرتبةفالقيم الواردة في (ج)، الإشعاع السابق مع 2Gy أدى إلى انخفاض كبير في حجم كروي في مجموعة مراقبة، تقليد العلاج بالإشعاع، وعرض الإشعاع حساسية الخلايا بيكا. الإشعاع في تركيبة مع سيسبلاتين العلاج لا يؤدي إلى زيادة انخفاض كبير في حجم كروي (p> 0.05). ويبين مؤامرة مين إلى ماكس. (ج) تحسب فالقيم من 2-طريقة تحليل ANOVA من تحليل تجارب ألف وباء (د) WST8 يؤديها في يوم 16 كبديل للتحليل المتعلقة (المنطقة) الماغنيسيوم. تحليلات WST8 كانت قادرة على الكشف عن انخفاض كبير في الخلايا الحية بعد العلاج الكيماوي-الإشعاع (الإشعاع 2Gy وسيسبلاتين) بالمقارنة مع سيسبلاتين وحدها (ف = بين 0.017)، ومن ثم تظهر في الاستفادة من الجمع بين التحليل المتعلقة و WST8 مقايسة اللونية في وقت القراءة المقايسة. ويظهر المؤامرة دقيقة إلى الحد الأقصى. وهذا الرقم هو طبع من هاجمان، J. et al. 26، مع الإذن الممنوح من قبل المؤلفين ودفتر اليومية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كنا قادرين على وضع بروتوكول لإنشاء الماغنيسيوم استنساخه من خلية المعلقات، لكلا خطوط الخلايا، وفي التجارب الأولية، والخلايا السرطانية البشرية الأساسية. أولاً نحن تقييم اثنين من الأساليب المذكورة سابقا، وحددت العلا-الأسلوب، أسلوب حيث يتم استخدام ألواح الثقافة مع الأسطح التصاق منخفضة للغاية، أن تكون أكثر أماناً وأكثر موثوقية لتوليد موحدة الماغنيسيوم ثلاثي الأبعاد. من خلال الجمع بين أسلوبي منفصلة للمقايسة القراءة (بقاء حجم/منطقة وخلية)، هذا التحليل المتعدد الوسائط حساسة بما فيه الكفاية تحديد الفروق الصغيرة بين المجموعات. هذه هي الخطوة الأولى نحو إثبات الجدوى التقنية لدمج لاحق المقايسة في المسار السريري في مركزنا للرعاية الثالثية. في المستقبل، يمكن استخدامه (ط) تقييم قابلية الورم الفردية للأول-أو الثاني-/الخط الثالث العلاج بروتوكولات مشتركة (الكواشف الكيماوي، الإشعاع) والعلاج التجريبي البروتوكولات، (ثانيا) مزيد تميز الخلايا السرطانية من عينات جديدة والربط بين أنماط السطحية أو هيولى الجزيئية لاستجابة العلاج. الماغنيسيوم من العينات القادمة من تعريب ورم مختلفة، مثلاً، الابتدائية، والعقدة الليمفاوية خبيث، التي يمكن تخيلها.
طوال إقامة المراسم والأسلوب، استخدمنا خطوط الخلايا المعروفة مختلفة، يجري بضعة راسخة لعقود من الزمان. سن مجرد خطوط الخلية يثير الشك للاتصال وقابلية للخلايا السرطانية البشرية الفعلية الحالية، يفترض أنها بعد أن فقدت العديد من المؤشرات الجزيئية الخصائص والسمات المميزة. وكانت نتائج من تجارب في المختبر صعبة استنساخ الإنسان أو في فيفو المحاكمات27. ولذلك ركزنا على خط خلية التي تم إنشاؤها مؤخرا من الخلايا السرطانية الأولية البشرية في منشآتنا جيدا تتسم16. مع هذا الخط خلية بيكا، كانت قادرة على إجراء تجارب العلاج على نطاق أوسع، وأكدت التوقعات العلاج الحالية. وهذا يدعم نظرية أن الخلايا بيكا تعكس سلوك الورم البشرية الفعلية أفضل من الأخرى، أكثر العمر وباساجيد خطوط الخلايا التي شهدت العديد من الممرات. الخلايا التي قد تخضع للتحديد غير الفسيولوجية بسبب الظروف الطويلة الأجل في المختبر قد تحيز حساسية الإشعاع الكيماوي. في التجارب الأخيرة، وأكدنا في الجدوى مع الخلايا الأولية في ما يتعلق بتشكيل كروي موثوق بها؛ ومع ذلك، قد تجارب أخرى وأكبر التي يتعين القيام بها قبل أن يتمكن من تنفيذ الفحص السريري الروتينية.
فمن المفترض أن الماغنيسيوم وثقافة خلية ثلاثية الأبعاد تتفاعل بشكل عام مقارنة بشكل مختلف في 2D-الثقافة التقليدية عندما تتعرض لعقاقير العلاج الكيميائي أو الإشعاع 28. هندسة الماغنيسيوم يؤدي إلى رج إيصال الأوكسجين والتغذية من السطح الخارجي لنواة، وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن أيضا إيصال المخدرات إلى أجزاء مختلفة من الكتلة خلية ثلاثية الأبعاد ليست موحدة29. وعلاوة على ذلك، تبدو الخلايا في ثقافة كروي للحفاظ على بعض أنماط تعبير الجينات المرتبطة بالمقاومة للعقاقير في الحيوان نماذج 30. ونحن نقترح أن الإشعاع ما يسمى المقاومة، ميزة التي تم ربطها إلى سرطان الرأس والعنق في العديد من المرضى، أيضا نتيجة لتفاعل خلية خلية ومتميزة ميكرونفيرونمينتس مما يؤدي إلى اختلافات في إمدادات الأكسجين والنشاط الأيضي. ويمكن أن تحاكي هذه الظاهرة في الماغنيسيوم بسبب زيادة في فيفو الأداء الوظيفي. وفي الختام، استخدام الخلايا الأولية وتوليد الماغنيسيوم قد تسمح لنا بالحفاظ على العديد من الخصائص الممكنة في فيفو نمو الورم في تركيبة مع مقايسة فعالة من حيث تكلفة لدراسة استجابة العلاج الفردي.
ومن المؤكد أن هناك حدوداً للنهج. وحتى الآن، فإنه غير معروف كيف سوف تؤدي الخلايا من المرضى الفردية المختلفة في تحليل التعرض لعلاج الورم، وكيفية التنبؤ المقايسة فيما يتعلق بالارتباط مع نتائج العلاج لاحقاً. دراسات المفرطة ضرورية ببساطة مقارنة الأداء في المختبر مقابل السريرية بالطبع. بين أمور أخرى، هما اثنين من العوامل المساهمة في هذا الغموض: التغاير الورم وانعدام ثقافة المشارك مع الخلايا اللحمية ومحصنة. عدم تجانس الورم هو ظاهرة غير مفهومة تماما وموجود بين المواقع الفرعية المختلفة من المرحلة الابتدائية، وكذلك بين الترجمة الأولية والمنتشر12. منذ الدراسات الأخيرة، هناك موقع ثالث حيث متميزة للغاية، ويمكن أن توجد الخلايا السرطانية المتخصصة وتسود في المنافذ: الدم ونخاع العظم قادرة على إيواء تعميم ونشر ورم الخلايا9،10. عدم وجود أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا اللحمية والخلايا التائية (كممثل لنظام المناعة) في خلية ثقافة لا يقتصر التحليل، ولكن عيب صالحة لمعظم في المختبر فحوصات دراسة قابلية العلاج الورم. في ضوء الموافقات المخدرات الحديثة والدراسات الجارية التي تؤثر على استجابة خلايا T، يجب أن تجري التجارب المقبلة لاكتشاف المخدرات في مزيج من فحوصات مختلفة وأساليب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وكان تمويل هذا المشروع بمنحه من جامعة ميونيخ (مشروع FöFoLe--رقم: 789-781).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
References
- Hunter, K. D., Parkinson, E. K., Harrison, P. R. Profiling early head and neck cancer. Nat Rev Cancer. 5 (2), 127-135 (2005).
- Jerjes, W., et al. The effect of tobacco and alcohol and their reduction/cessation on mortality in oral cancer patients: short communication. Head Neck Oncol. 4, 6 (2012).
- Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
- Boeckx, C., et al. Anti-epidermal growth factor receptor therapy in head and neck squamous cell carcinoma: focus on potential molecular mechanisms of drug resistance. Oncologist. 18 (7), 850-864 (2013).
- Brand, T. M., Iida, M., Wheeler, D. L. Molecular mechanisms of resistance to the EGFR monoclonal antibody cetuximab. Cancer Biol Ther. 11 (9), 777-792 (2011).
- Seidl, D., Schild, S. E., Wollenberg, B., Hakim, S. G., Rades, D. Prognostic Factors in Patients Irradiated for Recurrent Head-and-Neck Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6547-6550 (2016).
- Shirai, K., et al. Clinical Outcomes of Definitive and Postoperative Radiotherapy for Stage I-IVB Hypopharyngeal Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6571-6578 (2016).
- Theile, D., et al. Evaluation of drug transporters' significance for multidrug resistance in head and neck squamous cell carcinoma. Head Neck. 33 (7), 959-968 (2011).
- Slade, M. J., et al. Comparison of bone marrow, disseminated tumour cells and blood-circulating tumour cells in breast cancer patients after primary treatment. Brit J Cancer. 100 (1), 160-166 (2009).
- Mockelmann, N., Laban, S., Pantel, K., Knecht, R. Circulating tumor cells in head and neck cancer: clinical impact in diagnosis and follow-up. Eur Arch Otorhinolaryngol. 271 (1), 15-21 (2014).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
- Ledgerwood, L. G., et al. The degree of intratumor mutational heterogeneity varies by primary tumor sub-site. Oncotarget. 7 (19), 27185-27198 (2016).
- Loyo, M., et al. Lessons learned from next-generation sequencing in head and neck cancer. Head Neck. 35 (3), 454-463 (2013).
- Morris, L. G., et al. The Molecular Landscape of Recurrent and Metastatic Head and Neck Cancers: Insights From a Precision Oncology Sequencing Platform. JAMA Oncol. , (2016).
- Bauml, J. M., Cohen, R. B., Aggarwal, C. Immunotherapy for head and neck cancer: latest developments and clinical potential. Ther Adv Med Oncol. 8 (3), 168-175 (2016).
- Mack, B., et al. Rapid and non-enzymatic in vitro retrieval of tumour cells from surgical specimens. PLoS One. 8 (1), e55540 (2013).
- Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 939-954 (2016).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. J Biomol Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Cancer Genome Atlas, N. Comprehensive genomic characterization of head and neck squamous cell carcinomas. Nature. 517 (7536), 576-582 (2015).
- Duarte, S., et al. Isolation of head and neck squamous carcinoma cancer stem-like cells in a syngeneic mouse model and analysis of hypoxia effect. Oncol Rep. 28 (3), 1057-1062 (2012).
- Reid, P. A., Wilson, P., Li, Y., Marcu, L. G., Bezak, E. Current understanding of cancer stem cells: Review of their radiobiology and role in head and neck cancers. Head Neck. 39 (9), 1920-1932 (2017).
- Cossu, F., et al. Structural Insight into Inhibitor of Apoptosis Proteins Recognition by a Potent Divalent Smac-Mimetic. PLoS ONE. 7 (11), e49527 (2012).
- Hagemann, J., et al. Spheroid-based 3D Cell Cultures Enable Personalized Therapy Testing and Drug Discovery in Head and Neck Cancer. Anticancer Res. 37 (5), 2201-2210 (2017).
- Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies? PLoS Med. 7 (3), e1000245 (2010).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Chitcholtan, K., Asselin, E., Parent, S., Sykes, P. H., Evans, J. J. Differences in growth properties of endometrial cancer in three dimensional (3D) culture and 2D cell monolayer. Exp Cell Res. 319 (1), 75-87 (2013).
- Longati, P., et al. 3D pancreatic carcinoma spheroids induce a matrix-rich, chemoresistant phenotype offering a better model for drug testing. BMC Cancer. 13, 95 (2013).
