Процедура представлен складывая dCACHE периплазматическое лигандом привязки области Campylobacter jejuni Хеморецепция Tlp3 от включения органов и очистки приносить миллиграмм количества белка.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Метод эффективного складывая и очистки Хеморецепция лигандом привязки домена
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Идентификация природных лигандов хеморецепторы и структурных исследований, направленных на выяснение молекулярные основы лигандом специфики может быть значительно облегчено производства количествах миллиграмм чистой, сложить лигандом связывания доменов. Попытки участием Экспресс периплазматическое лигандом связывания доменов бактериальной хеморецепторов в Escherichia coli (E. coli) часто привести их ориентации в включение тела. Здесь для восстановления белка от включения органов, складывая и очистки, используя домен привязки лигандом периплазматическое dCACHE Campylobacter jejuni (C. jejuni) Хеморецепция Tlp3 качестве примера представлен метод. Этот подход включает в себя выражение протеина интереса с горные его6-тег, изоляции и мочевина опосредованной solubilisation включения органов, белка, складывая мочевины истощения, и очистки с помощью аффинной хроматографии, Затем тег удаления и размер исключения хроматографии. Спектроскопия круговой дихроизма используется для подтверждения сложенном состоянии чистого белка. Было продемонстрировано, что этот протокол является обычно полезно для производства количествах миллиграмм dCACHE периплазматическое лигандом связывания доменов других бактериальная хеморецепторов в виде растворимых и кристаллизирующихся.
Введение
Было показано, что хемотаксис и моторики играют важную роль в патогенезе Campylobacter jejuni , содействуя бактериальной колонизации и вторжения в узел1,2,3. Хемотаксис позволяет бактерии продвигаться к оптимальной среды для роста, как руководствоваться химические сигналы. Этот процесс предполагает признание внутриклеточные и экологических химические сигналы набор белков, называемых хеморецепторы, или датчика подобных белков (ПСТЛ). Большинство хеморецепторов являются белками мембраны встроенный с extracytoplasmic лигандом привязки домена (ОДД), трансмембранных домен....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. выражение его6-Tlp3-LBD в E. coli
- Прививать 150 мл стерильного Бертани Лурия (LB) бульон, содержащий ампициллина-1 мл 50 мкг с BL21-Codon-плюс (DE3) - RIPL клеток превращается с pET151/D-TOPO вектор для выражения его6- Tlp3-LBD (аминокислотных остатков 42-291), и Проинкубируйте ее при 37 ° C в шейкере (Диаметр орбиты, 25 мм) с 200 rpm на ночь.
- Подготовьте шесть колбы Эрленмейер 2 Л, содержащий 800 мл стерильного LB отвара и ампициллин-1 мл 50 мкг. Прививать каждый флакон с 20 мл на ночь культуры, полученные из шага 1.1. Инкубируйте их при 37 ° C с непрерывной тряски на 200 об/мин до оптической....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рекомбинатные выражение его6-Tlp3-LBD в E. coli в результате осаждения белков в включения органов. Выражение доходность от 1 Л бактериальной культуры, рассчитанные на шаге 2.13 был приблизительно 100 мг его6-Tlp3-LBD, депонируется в включения органов. Процедура изоляции белка, здесь описаны и проиллюстрированы на рис. 1, состоит из solubilisation включения органов, складывая белка и очистки, посредством Хромотография сродства, у.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Простая процедура для выражения и складывая от включения органов периплазматическое LBD бактериальных Хеморецепция Tlp3 представлен. Подготовка чистого белка подразумевает гиперэкспрессия кодировке ПЭТ плазмид ген в E. coli, очистки и solubilisation включения органов, складывая денатурированного протеина и его очистки, подряд сходства и Размер-гель-проникающей хроматографии шаги. Мочевина способствует денатурации и разбавления/диализа опосредованной складывая являются важнейшие шаги в протоколе, оптимизация кото.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Мы благодарим Yu C. Лю за его ранние работы на Tlp3-LBD производство. Майра A. Мачука долгу Departamento Admistrativo де науки, Tecnología e Innovación материалом для докторской стипендии.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Трис основание | AMRESCO | 497 | |
| Хлорид натрия (NaCl) | MERK MILLIPORE | 1064041000 | |
| Ампициллин | G-BIOSCIENCES | A051-B | |
| Фенилметансульфонилфторид (PMSF) | MERCK | 52332 | |
| Triton x-100 | AMRESCO | 694 | |
| Изопропил &бета;-D-тиогалактозид (IPTG) | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | ||
| Мочевина | АМРЕСКО | VWRC0568 | |
| Дитиотреитол | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | C-1029 | |
| L-аргинин моногидрохлорид | SIGMA-ALDRICH | A5131 | |
| Восстановленный L-глутатион | SIGMA-ALDRICH | G4251 | |
| Окисленный L-глутатион | SIGMA-ALDRICH | G4376 | |
| Натрия фосфат двухосновной (Na2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | 7558-79-4 | |
| Одноосновной фосфат натрия (2PO4) | SIGMA-ALDRICH | 10049-21-5 | |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота динатриевая соль дегидрат (ЭДТА) | AMRESCO | VWRC20302.260 | |
| Имидазол | SIGMA-ALDRICH | I2399 | |
| Глицерин | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | ||
| Хлорид никеля (NiCl2) | SIGMA-ALDRICH | 339350 | |
| Глицин | AMRESCO | VWRC0167 | |
| Додецилсульфат натрия (SDS) | SIGMA-ALDRICH | L4509 | |
| Неокрашенный белковый лестница, широкий Диапазон (10-250 кДа) | NEW ENGLAND BIOLABS | P7703 | |
| Центробежный концентратор Amicon Ultracel (Millipore) | MERCK | UFC901096 | |
| 50 мл Трубка Falcon | BDAA352070 | ||
| Трубка для диализа | LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY | Диализная | |
| трубка для диализа из змеиной кожи | THERMO SCIENTIFIC™ | 68100 | |
| Предварительно упакованный HiTrap хелатирующая колонка | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 17-0408-01 | |
| EmulsiFlex-C5 гомогенизатор высокого давления | AVESTIN | EmulsiFlex™ - C5 | |
| Перистальтический насос P-1 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 18-1110-91 | |
| Superdex 200 HiLoad 26/60 колонна исключения размера | GE HEALTHCARE LIFE | ||
| СПЕКТРОПОЛЯРИМЕТР JASCO J-815 | JASCO | J-815 |
Ссылки
- Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
- Josenhans, C., Suerbaum, S.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
