هذا أسلوب تحديد البروتينات رواية يتفاعل الحمض النووي في المكاني مستهدفة محددة، تعتمد على التقاط تسلسل على حدة من الكروماتين كروسلينكيد للتحاليل اللاحقة البروتين. لا معرفة مسبقة عن إمكانية ربط البروتينات، ولا خلية إدخال تعديلات مطلوبة. وضعت في البداية للخميرة، التكنولوجيا قد تم تكييفها لخلايا الثدييات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تكيف تهجين التقاط البروتينات المرتبطة بلونين للبروتينات في خلايا الثدييات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التقاط التهجين من البروتينات المرتبطة بلونين للتكنولوجيا البروتيوميات (هيككاب) وضعت في البداية للكشف عن تفاعلات البروتين الحمض النووي رواية في الخميرة. وهو يسمح تحليل للمنطقة المستهدفة من الفائدة دون الحاجة إلى معرفة مسبقة حول البروتينات المحتمل منضمة إلى المنطقة المستهدفة. هذا، من الناحية النظرية، يسمح هيككاب استخدامها لتحليل أي منطقة الجينوم بالفائدة، ويوفر المرونة الكافية للعمل في نظم خلية مختلفة. ليس المقصود من هذا الأسلوب لدراسة مواقع الربط لعوامل النسخ المعروفة، مهمة أكثر ملاءمة "الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن" (شريحة) وأساليب مثل الرقائق. قوة هيككاب تكمن في قدرتها على استكشاف مناطق الحمض النووي التي يوجد محدودة أو أي علم عن البروتينات منضمة إليها. قد يكون أيضا وسيلة مريحة لتجنب التحيز (موجودة في أساليب مثل رقاقة) عرضته تخصيب الكروماتين على أساس البروتين باستخدام الأجسام المضادة. يحتمل أن تكون، هيككاب يمكن أن تكون أداة قوية للكشف عن تفاعلات الحمض النووي-البروتين رواية حقاً. وحتى الآن، التكنولوجيا الغالب طبق لخلايا الخميرة أو تسلسل تكرار نسخة عالية في خلايا الثدييات. ولكي تصبح أداة قوية ونحن نتصور، حاجة هيككاب النهج الأمثل لكفاءة التقاط المكاني نسخة واحدة في خلايا الثدييات. نقدم هنا، لدينا تكييف الخميرة الأولية هيككاب القبض على بروتوكول لخطوط الخلايا البشرية، وتبين أن مناطق الكروماتين نسخة واحدة يمكن أن تكون معزولة كفاءة مع هذا البروتوكول المعدل.
المقدمة
خلال العقد الماضي، قد شهدت تحسن كبير في تسلسل التكنولوجيات، والسماح لدراسة طائفة واسعة من مورثات في عدد كبير من العينات، ومع قرار مذهل. وقد قدم الكونسورتيوم موسوعة عناصر الحمض النووي (ترميز)، جهدا مؤسسية متعددة على نطاق واسع تتصدره المعهد الوطني لبحوث الجينوم البشري من "المعاهد الوطنية للصحة"، ثاقبة عوامل النسخ كيف الفردية وربط البروتينات التنظيمية الأخرى والتفاعل مع الجينوم. وتتميز الجهد الأولى تفاعلات الحمض النووي-البروتين محددة، كما يقيمها الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (شريحة) ل البروتينات الحمض النووي ملزم المعروفة ما يزيد على 1001. أساليب بديلة مثل الدناز footprinting2 وفورمالدهايد ساعد عزل العناصر التنظيمية (فير)
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. التقاط اليغنوكليوتيد التصميم
-
تصميم لوحة النوكليوتيد لاستخدامها أثناء التقاط التهجين ق/المنطقة المستهدفة.
- تهدف إلى تصميم النوكليوتيد 4 – 8 في المنطقة المستهدفة، ولكن كحد أدنى، وتصميم واحد على الأقل اليغنوكليوتيد استهداف كل نهاية من المنطقة المستهدفة.
- إذا كان الهدف تسلسل طويل (> 500 زوج قاعدي)، تصميم النوكليوتيد كانتشار بقدر الإمكان لضمان فعالية إثراء الكروماتين عبر المنطقة المستهدفة بأكملها.
ملاحظة: لقد لاحظنا يلتقط الأمثل مع النوكليوتيد 4 – 8. على الرغم من أن هذه العملية يمكن أن يعمل جيدا مع النوكليوتيد أكثر، فإنه ليس من غير المألوف لمراقبة انخفاض غلة الإثراء عندما تستخدم النوكليوتيد كثيرة جداً.
....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نظراً للحاجة لكميات المدخلات من الكروماتين هيككاب أن تنجح، وتزرع الخلايا إلى مستويات عالية نسبيا من كونفلوينسي. تريبان تلطيخ الأزرق يستخدم للتأكد من أن معدلات الوفاة خلية معتدلة (< 10%). في نسخة واحدة التجارب، الكروماتين المحتوى قبل التهجين القبض يجب أن يكون في نطاق فيمتومولار، التي عادة ما يتطلب على الأقل 109 خلايا كابتداء من المواد. قبل تجارب واسعة النطاق، من المستحسن اختبار الأداء اليغنوكليوتيد الالتقاط في مجموعات صغيرة. يلتقط التهجين باستخدام معايرة النوكليوتيد مبينة في .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد هيككاب الطريقة الموضحة هنا العديد من الميزات الفريدة التي تجعل من نهج قوية للكشف عن التفاعلات بين الحمض النووي وإلا سيظل بعيد المنال. طبيعة العملية يعطي هيككاب المرونة اللازمة للعمل في مختلف الكائنات الحية ومناطق من الجينوم. وطريقة، ومع ذلك، يحتوي على العديد من القيود التي سينظر فيها.
هيككاب هو أسلوب الذي يتجنب أي تعديلات الخلية حيث أنه يحتمل أن يمكن أن تطبق في الخلايا الأولية، ونظم الثقافة الخلية، أو عينات الأنسجة حتى. بسبب ذلك، ومع ذلك، يتطلب عينات لتكون كروسلينكيد، مما يقلل من حساسية في.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
هناك لا تضارب في الكشف.
شكر وتقدير
ودعم هذا العمل P50HG004952 منح المعاهد الوطنية للصحة و R01GM109099 إلى mo.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أداة PrimerQuest | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT | تحليل التقاط قليل النوكليوتيدات | |
| PairFold | UBC | تحليل التفاعلات | |
| RPMI 1640 وسائل الإعلام | Thermo Fisher | 11875093 | |
| البنسلين الستربتومايسين | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| مصل بقري للجنين | Thermo Fisher | 26140079 | |
| Countess عداد خلية آلي | Thermo Fisher | ||
| 850 سم 2< / sup> زجاجة أسطوانة ؛ | Greiner Bio-one | 680058 | |
| Roller System | Wheaton | 22-288-525 | |
| 37٪ الفورمالديهايد | سيجما ألدريتش | F8775 | |
| جلايسين | سيجما ألدريتش | ||
| إيجبال CA-630 | سيجما ألدريتش | I3021 | |
| كوكتيل مثبط البروتياز | سيجما ألدريتش | P4380 | |
| هيبس | ثيرمو فيشر | 15630080 | |
| برانسون سونيفايتر رقمي SFX 150 | إيمرسون | ||
| كيوبيت 3.0 مقياس الفلور | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA BR مجموعة | الفحص Thermo Fisher | Q32850 | |
| Bioanalyzer 2100 | مجموعة Agilent Agilent | ||
| 1000 | Agilent | 5067-1504 | |
| MES ملح الصوديوم | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| NaCl 5M | Thermo Fisher | AM9760G | |
| EDTA | مغناطيس Sigma-Aldrich | ||
| DynaMag-2 | Thermo Fisher | 12321D | |
| DynaMag-15 مغناطيس | Thermo Fisher | 12301D | |
| Dynabeads M-280 atreptavidin | Thermo Fisher | 60210 | |
| أنابيب ربط منخفضة | Eppendorf | 22431081 | |
| فرن التهجين | SciGene | ||
| شاكر أنبوبي ودوار | ثيرمو فيشر | 415110Q | |
| DNase I (خالي من RNase) | نيو إنجلاند BioLabs | M0303 | |
| SSC buffer 20 & مرة مركزة | Sigma-Aldrich | S6639 |
المراجع
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2013).
- Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
