Здесь мы представляем протокол для анализа к ячейке передачи колебательного информации по optogenetic управления и жить мониторинга экспрессии генов. Этот подход обеспечивает уникальную платформу для тестирования функциональное значение динамического ген выражение программ в многоклеточных систем.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Метод Optogenetic для контроля и анализа картин выражения гена в ячейке для взаимодействия
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Клетки должны должным образом реагировать на височно меняющихся средах, которые находятся под влиянием различных факторов от окружающих клеток. Паз, сигнальный путь является одной из таких важнейших молекулярных механизмов для коммуникаций в ячейке, которая играет ключевую роль в нормальное развитие зародышей. Этот путь включает в себя к ячейке передачи колебательного информации с Ультрадианных ритмов, но несмотря на прогресс в методы молекулярной биологии, она была сложной для выяснения влияния многоклеточных взаимодействия колебательных гена динамика. Здесь мы представляем протокол, который позволяет optogenetic контроль и живой мониторинг картин выражения гена в височной точно. Этот метод успешно показал, что межклеточной и внутриклеточной периодические входы сигнализации Notch увлекают внутренние колебания перестройкой частоты и фазы, переход на одну ячейку резолюции. Этот подход применим к анализ динамических особенностей различных сигнальных путей, предоставляя уникальную платформу для тестирования функциональное значение динамического ген выражение программ в многоклеточных систем.
Введение
К ячейке коммуникации играют решающую роль в эмбриональных патронирования в процессы развития. В позвоночных эмбрионы выпол структуры, называемые сегменты формируются вдоль оси передней задней тела с прецизионной точностью височной под контролем времени поддержанию часы, под названием сегментации будильник1. В ходе этого процесса группы клеток presomitic мезодермы (PSM) периодически преобразуются в сегменты в синхронном режиме. Этот процесс включает экспрессии генов синхронизированные колебательных и PSM клетки, которые колеблются в фазе образуют же сегменты. Период экспрессии генов колебательной составляет около 2-3 ч в мышах и около 30 мин в ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. поколение стабильных клеточных линий по системе Tol2
-
Transfect векторы плазмиды (рис. 1A) модулей на основе Tol2 optogenetic вместе с вектором выражения Транспозаза (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) в C2C12 клетки. На всех этапах, культуры клеток с DMEM среднего дополнена 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и пенициллин стрептомицина при 37 ° C (таблица 1), при наличии 5% CO2, в противном случае обозначать.
- Граф trypsinized клетки с-счетчик соматических клеток и Клемная 5 x 104 C2C12 клеток на хорошо в пластине 12-Ну один день до transfection.
- Совместное transfect 0,375 мкг век....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы адаптировали Лайтон системы11,12, что позволяет выражение фото индуцированной гена в mammalian клетках, к изучению генетических осцилляторов с периодичностью 2 - 3-h. Эта система состоит из двух частей: Фото индуцибельной transcriptional активатор hGAVPO и UAS-промоутер кассеты на диск транскрипции произвольных генов интерес. Чтобы ускорить пульсирующего кинетика фото индуцированной генной экспрессии, поля последовательность в .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы показали метод для контроля динамики выражения гена с периодичностью 2-3 ч. Эта шкала времени намного короче, чем в других обычных систем, включая системы тет-на и оригинальная система Лайтон. Основные параметры для достижения Ультрадианных время весы являются полураспада фото индуцированной молекулярные продукты, мРНК и белков. Эти кинетические параметры могут зависеть от видов и типов клеток. Для настройки кинетики, заменив Hes1 3' УТР последовательности с другими является прямой путь, потому что она не изменяет пос.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Эта работа была поддержана JST, PRESTO (А.И.), основных исследований для эволюционной науки и техники (JPMJCR12W2 (р.к.)), субсидий для научных исследований в инновационных областях (Министерство образования, культуры, спорта, науки и техники (МПКСНТ), Япония 26119708 (А.И.) и 16 H 06480 (р.к.)), научные исследования () (Япония общества для поощрения науки (JSP) 24240049 (р.к.)) и молодых ученых (A) (JSP-страницы 15 H 05326 (А.И.)) и субсидий для научных исследований в инновационных областях «флуоресцирования Live imaging» МПКСНТ, Японии и платформы для динамического подходов для жизни системы от МПКСНТ, Япония.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| камера | Andor | iKon M-934 | |
| Микроскоп | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT аппарат | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Синий светодиодный осветитель | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Пенициллин-стрептомицин | Nacalai | 26253-84 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Sigma | 172012 KRYSTAL24 | |
| (черная 24-луночная пластина) | Hi-tech | 303012 | |
| D-люциферин Калий Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Экспометр | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| анти-HA-пероксидаза антитела | Roche | клон 3F10 | |
| антиактин-пероксидазы | антитела Wako | клон 2F3 |
Ссылки
- Hubaud, A., Pourquie, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells requi....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
