Descriviamo un protocollo per il rilevamento di detersivo sensibili interazioni tra proteine di membrana utilizzando l'associazione del ricevitore dell'ordinamento, sortilina, per il primo ciclo di luminal della proteina del trasportatore del glucosio, GLUT4, ad esempio.
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Articolo metodologico
Rilevamento di detersivo sensibili interazioni tra proteine di membrana
In questo articolo
Sommario
Abstract
La nostra capacità di esplorare le interazioni proteina-proteina è la chiave per comprendere collegamenti normativi nella cella. Tuttavia, rilevamento delle interazioni proteina-proteina in molti casi è associata con sfide sperimentali significative. In particolare, smistamento recettori interagiscono con il loro carico di proteine nel lume dei compartimenti di membrana spesso in maniera sensibile detergente, rendendo inutilizzabile la co-immunoprecipitazione di queste proteine. Associazione dell'ordinamento sortilina recettore al trasportatore di glucosio che GLUT4 può servire come un esempio di Luminale deboli interazioni tra proteine di membrana. Qui, descriviamo un test veloce, semplice e poco costoso per convalidare l'interazione tra sortilina e GLUT4. Per questo, abbiamo progettato e sintetizzato chimicamente il peptide myc-tagged corrispondente per l'epitopo sortilina-associazione potenziale nella parte luminale di GLUT4. Sortilina taggato con sei istidine è stato espresso in cellule di mammifero e isolato da lisati cellulari usando le perle di cobalto. Sortilina immobilizzata sulle perle è stato incubato con la soluzione del peptide a valori di pH diversi, e il materiale è stato analizzato mediante Western blotting. Questo test può essere facilmente adattato per studiare altre interazioni proteine sensibili al detersivo.
Introduzione
GLUT4 è una proteina del trasportatore del glucosio che si esprime principalmente in cellule di grasso e muscolo scheletrico dove media l'effetto dell'insulina, il glucosio post-prandiale sangue liquidazione1. Essendo una proteina molto stabile, GLUT4 è regolamentata a livello post-traduzionale. In assenza di insulina, GLUT4 è in gran parte esclusi dalla membrana plasmatica (quindi bassa permeabilità basale per glucosio) ed è localizzata principalmente all'interno della cellula in piccole vescicole insulina-sensible a reagire (IRVs) e trans-Golgi network (TGN) che rischia di rappresentare il vano di donatore IRV. Somministrazione di insulina, i....
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Protocollo
1. movimentazione del Peptide
- Progettazione e ordinazione del peptide
- Scegliere la sequenza desiderata del peptide e aggiungere un tag, ad esempio myc epitopo (EQKLISEED) presso suo entrambi N - o C-terminus.
- Controllare la solubilità prevista del peptide in acqua, usando peptide solubilità calcolatrice http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Se la solubilità è basso, provare ad aggiungere un altro tag solubile in acqua per cambiare il bilanciamento di carica.
Nota: Abbiamo usato il peptide corrispondente al primo ciclo luminal (fll) di GLUT4 taggati con l'epitopo di myc (grassetto) al capolinea N (Myc-fll-GLUT4): LNAPQKVI....
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Risultati
Lisati sono stati preparati da 3T3 L1 cellule transfettate stabile con sortilina-myc/His5 e da cellule WT 3T3 L1, usate come controllo negativo. Entrambi lisati sono stati incubati con perle di cobalto a pH 6 o pH 8 e lavate accuratamente. Perline con proteine immobilizzate sono state incubate nella soluzione di Myc-fll-Glut4. Dopo attenti lavaggi, proteine legate ai talloni sono stati eluiti con 0,25 M imidazolo. Campioni sono stati sottoposti, insieme con i lisat.......
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Discussione
Sortilina è un recettore di evolutiva conservata multi-ligando proteina che è coinvolta in entrambi segnalazione alla membrana del plasma e intracellulare ordinamento eventi6,7. Tuttavia, la ricerca di ligandi di sortilina autentico (alcuni dei quali sono proteine di membrana luminale o integrale) è complicata come l'interazione di sortilina con alcuni dei suoi partner di associazione sembra essere sensibili ai detersivi. Di conseguenza, un facile e un approccio .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni di ricerca DK52057 e DK107498 dal NIH per Carolina X.P è stata sostenuta dalla formazione istituzionale grant 2T32DK007201 da NIH.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cocktail di inibitori della proteasi | Sigma | P8849 | per l'uso nella purificazione della proteina tag dell'istidina |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Corning | 21-040-CV | PBS |
| 1mL Siringa da insulina U-100 | BD | 329652 | 26G x 1/2 |
| BCA Kit per il dosaggio delle proteine | Pierce | 23228 | |
| Tampone di lavaggio | Boston BioProducts | BP-234 | Per la purificazione delle proteine His-tag |
| HisPur Resina di cobalto | Thermo Scientific | 89964 | |
| Tampone campione di tricina | Bio-Rad | 161-0739 | con SDS, bMercaptaethanol dovrebbe essere aggiunto |
| Eluizione Tampone | Boston BioProducts | BP-236 | per la purificazione delle proteine His-tag con 250mM di imidazolo |
| Mini-Protean Tris-Tricine gel prefabbricati 10-20% | Bio-Rad | 456-3115 | Per la separazione di peptidi e piccole proteine |
| Tris/Tricine/SDS che eseguono il tampone | Bio-Rad | 161-0744 | |
| Tampone di trasferimento | Boston BioProducts | BP-190 | Aggiungi il 20% di metanolo |
| Membrana in nitrocellulosa 0,45 mm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma | A9647 | BSA |
| Anti Myc | anticorpo Segnalazione cellulare | 2272 | |
| Peptide di | Genscipt | Personalizza l'ordine | |
| Precision Plus Protein Dual color Standarts | BioRad | 161-0374 |
Riferimenti
- Bogan, J. S. Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes. Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).
- Kandror, K. V., Pilch, P. F. The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers. Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).
- Pa....
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Ristampe e permessi
