كثيرا ما كانت التقليدية دراسات فقدان لوظيفة الجينات باستخدام الحيوانات خروج المغلوب مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً. على أساس انهانسر كريسبر بوساطة الطفرات الجسدية أداة قوية لفهم وظائف الجينات في الجسم الحي. هنا، نحن التقرير طريقة لتحليل تعمل خروج المغلوب في تكاثر خلايا المخيخ.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
فقدان وظيفة تحليل في الحبيبية للدماغ كريسبر بوساطة خلايا تستخدم في الرحم على أساس انهانسر نقل الجينات
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وكثيراً ما تشوه الدماغ بسبب الطفرات الوراثية. فك رموز الطفرات في الأنسجة المستمدة من المريض قد حددت المحتملة العوامل المسببة للأمراض. للتحقق من صحة بمساهمة من خلل تحور الجينات لتطوير المرض، هو توليد نماذج حيوانية تحمل الطفرات أحد النهج الواضح. بينما germline وراثيا نماذج الماوس (جيمس) هي أدوات البيولوجية شعبية ويحمل النتائج استنساخه، فإنه مقيد بالوقت والتكاليف. وفي الوقت نفسه، تمكن جيمس غير الخط غالباً ما استكشاف الجينات الدالة بطريقة أكثر جدوى. منذ الدماغ بعض الأمراض (مثل، أورام الدماغ) تظهر نتيجة جسدية ولكن لا germline الطفرات، نماذج الماوس تشيميريك غير germline، تتعايش فيه الخلايا العادية وغير العادية، يمكن أن تكون مفيدة لتحليل الأمراض ذات الصلة. في هذه الدراسة، ونحن التقرير طريقة لاستحثاث الطفرات الجسدية بوساطة كريسبر في المخيخ. على وجه التحديد، أننا استخدمت الشرطي تدق في الفئران، التي Cas9 و التجارة والنقل هي مزمنة المنشط بالمروج كاج (CMV محسن/الدجاج ß-أكتين) بعد لجنة المساواة العرقية-بوساطة جزئ الجينوم. الذاتي المصممة الواحد-دليل الكشف (سجرناس) وتسلسل recombinase لجنة المساواة العرقية، سواء ترميز في بناء بلازميد واحد، سلمت إلى الخلايا الجذعية الدماغ/السلف في مرحلة جنينية في الرحم انهانسر باستخدام. ونتيجة لذلك، كانت تسمية transfected الخلايا وخلاياها ابنه مع البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)، مما ييسر المزيد من التحليلات المظهرية. ومن ثم، هذا الأسلوب هو عرض التسليم على أساس انهانسر الجينات في خلايا الدماغ الجنينية بل تقترح أيضا رواية نهج كمي لتقييم الخسارة من الدالة كريسبر بوساطة تعمل.
المقدمة
أمراض الدماغ واحدة من أفظع أمراض مميتة. أنهم غالباً ما تنجم عن طفرات وراثية والتقلبات اللاحقة. لفهم الآليات الجزيئية لأمراض المخ، اكتشف من أي وقت مضى تدوم الجهود الرامية إلى فك الجينوم البشري المرضى عددا من الجينات المسببة المحتملة. حتى الآن، استخدمت نماذج حيوانية germline وراثيا في فيفو مكسب-من-وظيفة (صندوق القناص) وخسارة للدالة (LOF) تحليلات لمثل هذه الجينات المرشحة. نظراً لتسارع تطور الدراسات الفنية التحقق من الصحة، أكثر عمليا ومرناً في فيفو جينات مقايسة نظاما لدراسة وظيفة الجينات المرغوب فيه.
تطبيق نظام نقل الجينات على أساس انهانسر في فيفو على الدماغ الماوس مناسبة لهذا الغرض. في الواقع، أظهرت عدة دراسات في....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
جميع التجارب على الحيوانات وأجريت وفقا للوائح الرفق بالحيوان وأقرتها السلطات المسؤولة (كارلسروه Regierungspräsidium، الموافقة على الأرقام: G90/13، G176/13، و G32/14، G48/14، و G133/14).
1-توليد والبلازميدات pU6-سجرنا-Cbh-لجنة المساواة العرقية
- تصميم سجرنا لاستهداف جين لفائدة وفقا للبروتوكول المنشورة سابقا14.
ملاحظة: في هذه التجربة، تم تصميم سجرناس اثنين لاستهداف الجين Top2b الماوس وسجرنا تحكم غير المستهدفة (الجدول 1). لاستخدام التكنولوجيا كريسبر gene(s) خروج المغلوب، حاجة سجرناس أن تكون مصممة لاستهداف الترميز تسلسل 5 ' المنطقة أو المجال الوظيفية الأساسية من البروتين. نقطة انطلاق ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في فيفو التحليل الوظيفي، من المهم تحديد الخلايا التي أدخلت gene(s) الخارجية. بينما تعبير محدد، مثل التجارة والنقل في الخلايا غير آخذة في الانتشار يمكن أن تكون متابعة لفترة طويلة من الزمن، الإشارة التتابع يضيع في تكاثر الخلايا. مثال على ذلك يتجلى في الشكل 1. للالتفاف حول فقدان البصمة transfected الخلايا في تحليلات LOF، طورنا نهجاً جديداً من خلال الجمع بين التسليم على أساس انهانسر الجينات مع التكنولوجيا كريسبر/Cas9.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
استخدام انهانسر الرحم أكسو ، أبلغنا سابقا على أساس siRNA في فيفو الوظيفية تحليلات Atoh1 في مرحلة مبكرة من الحبيبية للدماغ الخلية التمايز8. سبب siRNA تمييع/تدهور والتعرض للأجنة خارج جدار الرحم، اقتصر التحليل المظهرية من الخلايا الحبيبية اليكتروبوراتيد المراحل الجنينية. ومع ذلك، الطريقة الحالية لتمكين تحليل النمط الظاهري للحيوانات بعد الولادة.
دراستنا السابقة أثبتت أن خروج المغلوب Cas9 بوساطة من القامع الورم Ptch1 عبر في الرحم انهانسر ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ونحن نقدر سيبر لورا وأنا نوربورج، هاريم ياسين وشروتر بترا للمساعدة التقنية. كما نشكر الدكتور ك. ريفينبيرج، ك. Dell وص Prückl لمساعدة مفيدة للتجارب على الحيوانات في هذا؛ التصوير الأساسية تسهيلات هذا ومركز تصوير كارل زايس في هذا للتصوير المجهري [كنفوكل]. وأيد هذا العمل الأوقيانوغرافية دويتش، كا 4472/1-1 (ل D.K.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Alexa 488 Goat Anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 التخفيف |
| Alexa 568 تقنيات الحمار المضادة للفأر | A-10037 | 1:400 التخفيف | |
| Alexa 594 الحمار المضاد للأرانب | ThermoFisher | A21207 | 1:400 التخفيف |
| Alexa 647 تقنيات الحمار المضادة للأرانب | A31573 | 1:400 التخفيف | |
| القلوي الفوسفاتيز (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| الأوتوكلاف الفرقة | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) NEB | R3136S | ||
| BbsI (FastDigest) ThermoFisher | FD1014 | ||
| ورق ترشيح السليلوز (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| قماش | Tork | 530378 | |
| مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1: 1000 التخفيف |
| قوالب بلاستيكية يمكن التخلص منها (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| مصل | الحمارسيجما ألدريتش | D9663 | |
| EcoRI (HF) NEB | R3101S | ||
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| مرهم العين (Bepanthen) | باير | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| (0.22 وميكرو ؛ م) | ميرك | F8148 | |
| جهاز تصوير الخلايا الفلورية (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| ملقط مستقيم | أدوات العلوم الدقيقة | 91150-20 | |
| شاش (X100 ES-pads 8f 10 × 10 سم) | فيشر ساينتفيك | 15387311 | |
| GFP الجسم المضاد | Abcam | ab13970 | 1: 1000 |
| جيبسون الجمعية ماستر ميكس | NEB | E2611S | |
| زجاج شعري مع خيوط | Narishige | GD1-2 | |
| وسادة تسخين | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| برنامج معالجة الصور (ImageJ وفيجي) | الأنسولين NIH | ||
| -(B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS لومينا LT سلسلة III الفرجار | بيركين إلمر | CLS136331 | |
| إبر خياطة كالت | أدوات العلوم الدقيقة | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY مزيج | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 الأجسام المضادة | Abcam | ab15580 | 1: 500 التخفيف |
| المؤشر | الضوئي | PL3000 | |
| قلم مانع السوائل | Kisker التكنولوجيا الحيوية | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT-Microgrinder | ||
| Narishige | EG-45 | ||
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| برنامج المجهر ZEN | Zeiss-خيوط | ||
| خياطة حريرية غير معقمة (0.12 مم) | أدوات العلوم الدقيقة | 18020-50 | |
| O.C.T. مركب (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 الجسم المضاد | BD Bioscience | 610241 | 1: 200 التخفيف |
| بارافورمالديهايد | روث | 335.3 | |
| PBS ( 1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 البلازميد | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| طقم ربط سريع | NEB | M2200S | |
| ملقط دائري | أدوات العلوم الدقيقة | 11103-09 | |
| شرائح (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| للإحصاء الحيوي (المنشور 7) | برنامج GraphPad ، | Inc-Spitacid | |
| EcoLab | 3003840 | ||
| المجهر المجسم | نيكون | C-PS | |
| السكروز | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| مقص جراحي | أدوات العلوم الدقيقة | 91460-11 | |
| مقص جراحي بطرف غير حاد | أدوات العلوم الدقيقة | 14072-10 | |
| خياطة (Supramid schwarz DS 16 ، 1.5 (4/0)) SMI | 220340 | ||
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| مقص مناديل بلانت (11.5 سم) | أدوات العلوم الدقيقة | 14072-10 | |
| TOP2B الأجسام المضادة | سانتا كروز | sc13059 | 1: 200 تخفيف |
| التربسين (2.5٪) ملاقط | ThermoFisher | 15090046 | |
| w / 5mm & Oslash ؛ أقطاب القرص Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Dr & auml ؛ جيرويرك AG | GS186 |
المراجع
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
