传统的利用基因敲除动物进行的基因功能缺失研究通常成本高昂且耗时。基于电穿孔的CRISPR介导体细胞突变技术是研究基因功能的强大工具。 体内在此，我们报告一种用于分析小脑增殖细胞中基因敲除表型的方法。
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方法文章
使用CRISPR介导的功能缺失分析研究小脑颗粒细胞 子宫内 基于电穿孔的基因转移
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
脑部畸形通常由基因突变引起。解析患者来源组织中的突变已帮助识别出多种潜在致病因素。为了验证突变基因功能障碍对疾病发展的贡献，构建携带这些突变的动物模型是一种显而易见的方法。尽管生殖系基因工程小鼠模型（GEMMs）是常用的生物学工具且具有可重复的结果，但其应用受限于时间和成本。相比之下，非生殖系GEMMs通常能以更可行的方式探索基因功能。由于某些脑部疾病（例如，脑肿瘤）似乎由体细胞突变而非种系突变引起，因此正常细胞与异常细胞共存的非种系嵌合小鼠模型可能有助于开展与疾病相关的分析。在本研究中，我们报道了一种在小脑中诱导CRISPR介导的体细胞突变的方法。具体而言，我们使用了条件性基因敲入小鼠，其中 Cas9 和 GFP 处于慢性激活状态 CAG （CMV增强子/鸡ß-actin）启动子之后 Cre介导的基因组重组。将自设计的单导向RNA（sgRNAs）和Cre重组酶序列共同构建于同一质粒中，在胚胎期通过 在子宫内 电穿孔。因此，转染的细胞及其子代细胞均被绿色荧光蛋白（GFP）标记，从而便于进一步的表型分析。该方法不仅展示了基于电穿孔的基因递送技术在胚胎小脑细胞中的应用，还提出了一种评估CRISPR介导的功能缺失表型的新型定量方法。
引言
脑部疾病是最令人畏惧的致命疾病之一，通常由基因突变及其后续的调控失调引起。为了理解脑部疾病的分子机制，研究人员持续不断地对人类患者的基因组进行解析，已鉴定出多个潜在的致病基因。迄今为止，已利用生殖系基因工程动物模型开展相关研究 体内 功能获得（GOF）和功能缺失（LOF）分析是针对此类候选基因的常用方法。随着功能验证研究的快速发展，一种更为可行且灵活的 体内 用于研究基因功能的基因检测系统是可取的。
应用一个 体内 基于电穿孔的基因转移系统适用于发育中小鼠大脑的这一目的。事实上，已有多个研究采用了这种方法 在子宫内 电穿孔已显示出在发育中的大脑中进行功能分析的潜力1,2,3实际上，小鼠大脑的多个区域，例如大脑皮层4，视网膜5间脑6, 后脑7小脑8和脊髓9 迄今为止，已通过体细胞基因递送方法靶向了这些目标。
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方案
所有动物实验均按照动物福利法规进行，并已获得主管部门（卡尔斯鲁厄政府，批准编号：G90/13、G176/13、G32/14、G48/14 和 G133/14）的批准。
1. 构建 pU6-sgRNA-Cbh-Cre 质粒
- 根据先前发表的方案设计靶向目标基因的sgRNA14.
注意：本实验中设计了两种sgRNA以靶向小鼠 Top2b 基因和非靶向对照sgRNA（表1）。为了利用CRISPR技术敲除基因，需要设计靶向基因编码序列5'区域或蛋白质关键功能结构域的sgRNA。一个便捷的起点是测试公开可用的预设计sgRNA序列，例如GeCKO v2小鼠基因敲除文库15 来自张实验室。或者，可使用公开可用的软件设计sgRNA，例如以下网站：crispr.mit.edu。 - 将sgRNA克隆至pU6-sgRNA-Cbh-Cre载体中。
注意：pU6-sgRNA-Cbh-Cre 载体12 本研究中使用的质粒源自原始的 pX330 质粒16 通过将 SpCas9 的编码序列替换为 Cre 重组酶- 合成两条DNA寡核苷酸，序列如下： 正义链：....
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结果
对于 体内 功能分析中，关键是要鉴定出外源基因已导入的细胞。虽然在非增殖细胞中，标记物（如GFP）的表达可长期追踪，但在增殖细胞中，其信号会随着细胞分裂逐渐丢失。这一效应的示例如下所示： 图1为避免在功能缺失（LOF）分析中丢失转染细胞的痕迹，我们开发了一种新方法，将基于电穿孔的基因递送技术与CRISPR/Cas9技术相结合。
代表性结果如图2所示。通过将携带sgTop2b靶序列的质粒pU6-sgTop2b-Cbh-Cre和pCAG-EG-Top2b-FP17瞬时转染至稳定表达SpCas9的HEK293T细胞中，检测质粒构建物的功能（图2A）。由sgRNA引导的Cas9核酸酶活性可诱导EGFP表达盒发生双链断裂.......
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讨论
使用 子宫外 电穿孔，我们先前已报道基于siRNA的 体内 小脑颗粒细胞分化早期阶段 Atoh1 的功能分析8由于siRNA的稀释/降解以及胚胎在子宫外暴露，对电穿孔颗粒细胞的表型分析仅限于胚胎阶段。然而，当前方法实现了对出生后动物表型的分析。
我们之前的研究表明，Cas9介导的肿瘤抑制基因敲除 Ptch1 通过 在子宫内 电穿孔成功诱导了髓母细胞瘤2相比之下，当前方法具有两个主要优势：1）Cas9 无需与质粒共同递送，而是通过单个质粒携带多个sgRNA表达盒即可实现多基因靶向；2）靶细胞及其子代细胞可被GFP永久标记，从而实现对活细胞的可视化以及对转化肿瘤细胞行为的分析 体内.
该方案最关键的步骤是将质粒DNA准确地注射到正确位置，以及将电脉冲递送至大脑的适当区域。小脑神经元以出生时间依赖的方式，依次来源于小脑神经上皮。由于电穿孔技术仅在E1.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Laura Sieber、Anna Neuerburg、Yassin Harim 和 Petra Schroeter 在技术方面的协助。同时感谢 K. Reifenberg 博士、K. Dell 博士和 P. Prückl 在 DKFZ 动物实验中提供的有益帮助；感谢 DKFZ 成像核心设施以及 DKFZ 内卡尔蔡司成像中心提供的共聚焦显微成像支持。本研究由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）资助，项目编号 KA 4472/1-1（资助对象：D.K.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alexa 488 山羊抗鸡 | ThermoFisher | A11039 | 1:400 稀释 |
| Alexa 568 驴抗小鼠 | Life Technologies | A-10037 | 1:400 稀释 |
| Alexa 594 驴抗兔 | ThermoFisher | A21207 | 1:400 稀释 |
| Alexa 647 驴抗兔 | Life Technologies | A31573 | 1:400 稀释 |
| 碱性磷酸酶（FastAP） | ThermoFisher | EF0654 | |
| 高压灭菌指示带 | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| 纤维素滤纸（Whatman） | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| 布巾 | Tork | 530378 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | LSM800 | |
| D-荧光素 | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 稀释 |
| 一次性塑料模具（Tissue-Tek Cyromold） | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| 驴血清 | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| 电穿孔仪（Electro Square Porator） | BTX | ECM830 | |
| 无内毒素质粒大提试剂盒（Endofree Maxi Kit） | Qiagen | 12362 | |
| 乙醇 | Merck | 107017 | |
| 眼药膏（Bepanthen） | Bayer | 81552983 | |
| 快绿染料（Fast Green） | Merck | 104022 | |
| 胎牛血清（FBS） | ThermoFisher | 10270-016 | |
| 滤膜（0.22 µm） | Merck | F8148 | |
| 荧光细胞成像仪（ZOE） | Biorad | 1450031 | |
| 直头镊子 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| 纱布（X100 ES-pads 8f 10 × 10 cm） | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP 抗体 | Abcam | ab13970 | 1:1000 稀释 |
| 吉布森组装预混液（Gibson Assembly Master Mix） | NEB | E2611S | |
| 带纤维的玻璃毛细管 | Narishige | GD1-2 | |
| 加热垫 | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| 图像处理软件（ImageJ 和 Fiji） | NIH | - | |
| 胰岛素注射器（B. Braun OMNICAN U-100） | Carl Roth | AKP0.1 | |
| 异氟烷 | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt 缝合针 | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 抗体 | Abcam | ab15580 | 1:500 稀释 |
| 光导指针 | Photonic | PL3000 | |
| 疏水屏障笔 | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| 安乃近 | WDT | - | |
| 微电极研磨仪 | Narishige | EG-45 | |
| 显微注射仪 | Narishige | IM300 | |
| 微电极拉制仪 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 显微镜软件 ZEN | Zeiss | - | |
| 非无菌丝线缝合线（0.12 mm） | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. 包埋剂（Tissue-Tek） | VWR | 4583 | |
| p27 抗体 | BD bioscience | 610241 | 1:200 稀释 |
| 多聚甲醛 | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| 聚乙烯亚胺 | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 质粒 | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick 凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28704 | |
| 快速连接试剂盒（Quick Ligation Kit） | NEB | M2200S | |
| 环形止血钳 | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| 载玻片（SuperFrost） | ThermoFisher | 10417002 | |
| 生物统计学软件（Prism 7） | GraphPad Software, Inc | - | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| 体视显微镜 | Nikon | C-PS | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| 手术剪刀 | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| 钝头手术剪刀 | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| 缝合线（Supramid 黑色 DS 16, 1.5 (4/0)） | SMI | 220340 | |
| T4 DNA 连接缓冲液 | NEB | B0202S | |
| T4 多核苷酸激酶（T4 PNK） | NEB | M0201S | |
| 钝头组织剪刀（11.5 cm） | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B 抗体 | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 稀释 |
| 胰蛋白酶（2.5 %） | ThermoFisher | 15090046 | |
| 带5mm Ø 圆盘电极的镊子，铂金材质 | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| 麻醉蒸发器 | Drägerwerk AG | GS186 |
参考文献
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al.
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重印与许可
