Geleneksel işlev kaybı çalışmalar nakavt hayvanlar kullanarak genlerin kez pahalı ve zaman alıcı olmuştur. Somatik mutagenesis CRISPR-aracılı Elektroporasyon tabanlı gen içinde vivoişlevleri anlamak için güçlü bir araçtır. Burada, nakavt fenotipleri beyincik Proliferasyona hücrelerdeki analiz etmek için bir yöntem raporu.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
CRISPR-aracılı kaybı serebellar granül işlev analizinin gen transferi Elektroporasyon tabanlı rahim içinde kullanarak hücreleri
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Beyin malformasyonu kez tarafından genetik mutasyonlar neden olur. Hasta elde edilen dokular mutasyonların deşifre olası etken faktörleri hastalıkları tespit etti. İşlev bozukluğu hastalığı geliştirme mutasyona uğramış genler katkısını doğrulamak için mutasyon taşıyan hayvan modellerin üretimi bir açık yaklaşım. Genetik olarak germline iken fare modelleri (GEMMs) popüler biyolojik araçlardır ve tekrarlanabilir sonuçlar sergi, zaman ve maliyeti ile sınırlıdır. Bu arada, Sigara germline GEMMs kez daha uygun bir şekilde keşfetmek gen işlevini etkinleştirin. Bazı beyin beri hastalıklar (Örn, beyin tümörleri) üzerinden somatik neden gibi görünüyor ama değil germline mutasyonlar, Sigara germline chimeric fare modelleri, hangi normal ve anormal hücreleri bir arada, hastalık ilgili analiz için yararlı olabilir. Bu çalışmada, beyincik bedensel mutasyonlar CRISPR-aracılı indüksiyon için bir yöntemi bildirin. Özellikle, hangi Cas9 ve GFP kronik aktif CAG (CMV artırıcı/tavuk β-aktin) düzenleyici tarafından Cresonra koşullu çakma fareler, kullanılan-aracılı rekombinasyon genom kopyası. Kendini tasarlanmış tek-Kılavuzu RNA'ların (sgRNAs) ve Cre recombinase sıra, hem bir tek plazmid yapı kodlanmış serebellar kök/progenitor hücre içine rahim içinde Elektroporasyon kullanarak bir embriyonik aşamada teslim edildi. Sonuç olarak, transfected hücreleri ve onların kızı hücreleri böylece daha fazla fenotipik analizleri kolaylaştırmak yeşil flüoresan protein ile (GFP), etiketli. Bu nedenle, bu yöntem sadece Elektroporasyon tabanlı gen teslim embriyonik serebellar hücrelere gösterilen ama ayrıca CRISPR-aracılı işlev kaybı fenotipleri değerlendirmek için yeni bir kantitatif yaklaşım öneriyor.
Giriş
Beyin hastalıkları en korkunç ölümcül hastalıklardan biri vardır. Onlar genellikle genetik mutasyonlar ve sonraki bozukluk sonucu. Moleküler mekanizmalar beyin hastalıkları anlamak için şimdiye kadar süren çabaları insan hasta genleri deşifre için potansiyel sorumlu genlerin bir dizi keşfettim. Şimdiye kadar genetik olarak germline hayvan modelleri vivo içinde kazanç--fonksiyonu (GOF) ve işlev kaybı (LOF) analizleri gibi aday gen için kullanılan. Fonksiyonel doğrulama çalışmaları hızlandırılmış gelişimi nedeniyle, gen işlevi okuyan bir daha uygun ve esnek vivo içinde gen tahlil arzu edilen sistemdir.
Vivo Elektrop....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri hayvan refahı düzenlemelere göre yapılmıştır ve sorumlu yetkilileri tarafından onaylanmıştır (Regierungspräsidium Karlsruhe, onay numaraları: G90/13, G176/13, G32/14, G48/14 ve G133/14).
1. pU6-sgRNA-Cbh-Cre plazmid oluşturmak
- Gen--ilgi çekici bir daha önce yayımlanmış Protokolü14göre hedefe sgRNA tasarım.
Not: Bu deneyde iki sgRNAs fare Top2b gen ve bir sigara hedefli kontrol sgRNA (Tablo 1) hedeflemek için tasarlanmıştır. CRISPR teknolojisini kullanarak nakavt gene(s) için sgRNAs 5' bölgesinin kodlama dizisi ya da protein temel işlev etki alanı hedef için ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Vivo fonksiyonel analiz için eksojen gene(s) içine girmiştik hücrelerini tanımlamak için önemlidir. GFP sigara Proliferasyona hücrelerdeki uzun süre takip gibi bir işaretleyici ifade, sinyal sırayla Proliferasyona hücrelerde kayboluyor. Bu efekt bir çizimi Şekil 1' de gösterilmiştir. Ayak izi LOF analizlerde transfected hücrelerinin kaybetme aşmak için biz Elektroporasyon tabanlı gen teslim CRISPR/Cas9 teknoloji ile birleştirerek yeni bir yaklaşım ge.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Exo utero Elektroporasyon kullanarak, daha önce Atoh1 in vivo siRNA tabanlı fonksiyonel analizleri serebellar granül erken bir aşamada farklılaşma8hücre bildirdin. SiRNA seyreltme/bozulma ve embriyoların rahim duvarı dışında maruz kalma nedeniyle, fenotipik analiz electroporated granül hücre embriyonik aşamada sınırlıydı. Ancak, geçerli yöntem postnatal hayvanların fenotip analizini etkin.
Bizim önceki çalışma tümör baskılayıcı Ptch1 rahim.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Laura Sieber, Anna Neuerburg, yasin Harim ve Petra Schroeter teknik yardım için teşekkür ederiz. Biz Ayrıca Drs. K. Reifenberg, K. Dell ve P. Prückl DKFZ, hayvan deneyleri için yararlı yardım için teşekkür ederiz; Imaging Core tesislerinde DKFZ ve Carl Zeiss görüntüleme Merkezi DKFZ confocal mikroskobu görüntüleme için. Bu eser Deutsche Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (dk) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Alexa 488 Keçi anti-Tavuk | ThermoFisher | A11039 | 1:400 seyreltme |
| Alexa 568 Eşek Anti-Fare Yaşam Teknolojileri | A-10037 | 1:400 seyreltme | |
| Alexa 594 Eşek anti-Tavşan | ThermoFisher | A21207 | 1:400 seyreltme |
| Alexa 647 Eşek anti-Tavşan Yaşam | Teknolojileri | A31573 | 1:400 seyreltme |
| Alkali Fosfataz (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Otoklav bandı | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Selüloz Filtre Kağıdı (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Bezi | Tork | 530378 | |
| Konfokal lazer tarama mikroskobu | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 seyreltme |
| Tek kullanımlık plastik kalıplar (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Eşek serumu | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Elektro Kare Poratör | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Etanol | Merck | 107017 | |
| Göz merhemi (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Hızlı Yeşil | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filtre (0.22 & mikro; m) | Merck | F8148 | |
| Floresan hücre görüntüleyici (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forseps düz | Güzel Bilim Araçları | 91150-20 | |
| Gazlı Bez (X100 ES-pedler 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antikoru | Abcam | ab13970 | 1:1000 seyreltme |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Filamentli Cam Kılcal | Narishige | GD1-2 | |
| Isıtma Yastığı | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Görüntü İşleme yazılımı (ImageJ ve Fiji) | |||
| şırıngası (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isofluran | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Serisi III Kaliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Sütür İğneleri | Güzel Bilim Araçları | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART HAZIR karışımı | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antikoru | Abcam | ab15580 | 1:500 seyreltme |
| Işık İşaretçisi | Fotonik | PL3000 | |
| Sıvı engelleyici kalem | Kisker Biyoteknoloji | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT-Mikroöğütücü | ||
| Narishige | EG-45 | ||
| Mikroenjektör | Narishige | IM300 | |
| Mikropipet Çektirme | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Mikroskop yazılımı ZEN | Zeiss-Non-steril | ||
| İpek Sütür İpliği (0.12 mm) | Güzel Bilim Araçları | 18020-50 | |
| OCT Bileşik (Doku-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antikoru | BD bioscience | 610241 | 1:200 seyreltme |
| Paraformaldehit | Roth | 335.3 | |
| PBS ( 1x) | Yaşam Teknolojileri | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polietilenimin | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plazmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kiti | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti | Qiagen | 28704 | |
| Hızlı Ligasyon Kiti | NEB | M2200S | |
| Halka Forseps | Güzel Bilim Araçları | 11103-09 | |
| Slaytlar (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Biyoistatistik Yazılımı (Prizma 7) | GraphPad Yazılımı, | Inc-Spitacid | |
| EcoLab | 3003840 | ||
| Stereomikroskop | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Cerrahi makas | Güzel Bilim Araçları | 91460-11 | |
| Künt uçlu cerrahi makas | Güzel Bilim Araçları | 14072-10 | |
| Sütür (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligasyon Tamponu | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Doku makası Künt (11,5 cm) | Güzel Bilim Araçları | 14072-10 | |
| TOP2B antikoru | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 seyreltme |
| Tripsin (%2,5) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Cımbız, 5 mm ve Oslash ile; disk elektrotları Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Buharlaştırıcı | Drä gerwerk AG | GS186 |
Kaynaklar
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
