Method Article

异条件下具有不同刚度的聚乙烯醇-钴-衣康酸水凝胶的人多能干细胞培养

DOI:

10.3791/57314

⸱

February 3rd, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

提出了一种不同刚度的聚乙烯醇-共衣酸凝胶的制备方法, 并与无肽接枝, 研究了生物材料的硬度对其分化和增殖的影响。干细胞。水凝胶的刚度受交联时间的控制。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一些研究人员研究了物理线索, 如生物材料的硬度对干细胞增殖和分化的影响。然而, 这些研究人员大多用聚丙烯酰胺水凝胶进行干细胞培养。因此, 它们的结果是有争议的, 因为这些结果可能来源于聚丙烯酰胺的具体特性, 而不是生物材料的物理提示 (刚度)。在这里, 我们描述了一个用于制备水凝胶的协议, 它不是以聚丙烯酰胺为基础的, 它可以培养各种干细胞, 包括人类胚胎干细胞和人类诱导的多能干细胞 (iPS) 细胞。从 bioinert 聚乙烯醇-共衣酸 (P IA) 制备了不同刚度的水凝胶, 通过改变交联时间来控制交联度的刚度。以细胞外基质为基础, 研究了肽的 P IA 水凝胶作为干细胞培养和分化的未来平台。本文详细介绍了羊水干细胞、脂肪源性干细胞、人 ES 细胞和人类 iPS 细胞的培养和传代。肽的 P IA 水凝胶表现出优异的性能, 这是由它们的刚度特性引起的。该协议报告了生物材料的合成, 他们的表面操作, 以及控制的刚度性质, 最后, 它们对干细胞的命运的影响, 利用异的自由文化条件。根据最近的研究, 这种改良的基板可以作为未来的平台, 支持和指导各种干细胞线的命运, 以不同的联系;进一步, 再生和恢复失去的器官或组织的功能。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

干细胞分化为特定细胞谱系的命运和干细胞的长期增殖, 特别是人类诱导的多能 (iPS) 细胞和人类胚胎干细胞, 已知受抑制剂、生长因子和/或培养培养基中的小生物活性分子。最近, 生物材料的物理线索, 特别是细胞培养生物材料的硬度, 已被认为是一个重要的因素, 引导干细胞增殖和分化的命运1,2, 3、4、5、6。因此, 一些研究人员已经开始研究干细胞的命运, 它们在水凝胶上培养, 分化, 主要是采用不同刚度的聚丙烯酰胺水凝胶。

生物材料的硬度可以控制局灶粘连, 细胞形态学, 细胞表型和干细胞黏附, 特别是在二维 (2 维) 培养1,2,3,5。干细胞对生物材料的机械传感通常是通过整合素受体的黏着性信号来控制的。NMMIIA, nonmu....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究的实验得到了台湾 Landseed 医院 (IRB-13-05) 和国立中央大学伦理委员会的批准。在本研究中, 所有的实验都是按照所有相关的和适用的政府和机构的指导方针和规定进行的。

1. 解决方案和媒体准备

  1. 高分子提纯
    1. 用乙醇洗涤 p ia 水解 > 96.5% 的羧酸基团净化 p ia。在500毫升的圆锥烧杯中将20克的 P IA 放入200毫升的乙醇中, 在磁力搅拌器上搅拌 24-30 h. 每8-10 小时用新鲜乙醇交换乙醇。
    2. 用 chner 漏斗滤除乙醇中的 P IA。
    3. 室温下真空干燥24小时干燥 P IA。
      注: 建议在真空干燥系统 (通过去除乙醇) 经常清洗陷阱, 特别是在最初的几个小时内, 因为在从 P IA 去除大量乙醇后, 陷阱往往会堵塞。
  2. p-IA 溶液的制备
    注: 将聚合物慢慢加入溶剂 (水)。建议在溶剂中加入 P IA 至少15分钟。如果在聚合物中加入溶剂, 聚合物就不会完全溶解。小心不要产生爆炸性沸腾的 P IA 解决方案。在制备 P IA 溶液时使用防护眼镜。p ia 溶液的加热过程是溶解结晶 p-ia 的关键。建议 (最好) 在一个相对干净的实验室中, 如果可能的话, 准备 P IA 溶液。
    1. 溶解在纯净水中的 p....

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Results

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采用肽 (oligoECM) 或不同弹性的 ecm 接枝的 P IA 水凝胶是通过以下的反应方案来制备的, 如图 1A所示, 使用不同类型的 oligoECM (图 1B)。水凝胶的弹性由应用的交联强度 (时间) (图 1C) 调节。采用受精衍生肽接枝的 P IA 水凝胶, 具有25.3 帕 (24 h 交联时间) 的贮存模量, 支持人类 iPS 和 ES 细胞长期培养超过10-20 通道。特别是, 与关节段 (P-IA-24h-VN1G) 或双链 (P-IA-24h-VN2G) 接枝的 p-IA 水凝胶支持人类 iPS 和 ES 细胞的多, 它们的 oligoECM 浓度相对较低 (200-500 微克/毫升) 比 P-IA-VN1。水凝胶, 需要使用高浓度的 oligoECM (> 1000 微克/毫升), 以维护人类 iPS 和 ES 细胞的多28.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了长期扩展人类 ES 和 iPS 细胞, 在异自由条件下维持其多超过十通道, 以及对人类 AFS 细胞、广告细胞的培养, 建立了具有不同刚度的 p-ia-oligoECM 和 p-ia 型 ECM 水凝胶,和造血干细胞25,28,32。oligoECM 固定化的 p-IA 水凝胶是细胞培养材料研究细胞培养材料对不同类型的干细胞分化和增殖的命运以及原代细胞的影响的绝佳候选物。癌细胞。

p ia 解决方案应该是透明的, 当 p ia 的解决方案是在盘子上投。交联时间决定了 P IA 水凝胶的交联强度。24 h 交联的 P IA 水凝胶生产的最佳水凝胶的人 ES/iPS 细胞培养。任何肽和 ECMs 可以移植到 P IA 水凝胶使用该协议, 其中肽和 ECMs 有免费氨基酸组25,28.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项研究得到了部分支持的科技部, 台湾根据赠款编号 106-2119-m-008-003, 105-2119-m-008-006, 和 104-2221-e--008-107-MY3。这项研究也得到了台湾 Landseed 医院项目 (NCU-LSH-105-A-001) 的支持。还承认日本教育、文化、体育、科学和技术部的科研资助 (数字 15K06591)。a. 口想感谢沙特阿拉伯王国利雅得11451沙特国王大学国际科学伙伴计划 (ISPP-0062) 的研究生研究和研究副校长。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GTPGPQGIAGQRGVVPH 日本无规格：寡肽
缩写：Cyclic RGD， cRGD
GACRGDCLGAPH 日本无规格：寡肽
缩写：FN1
KGGAVTGRGDSPASSPH 日本无规格：寡肽
缩写：CS1
EILDVPSTPH 日本无规格： Oligopeptide
简称： VN1
KGGPQVTRGDVFTMPPH Japannone规格： Oligopeptide
缩写： HBP1
GKKQRFRHRNRKGPH Japan无规格： Oligopeptide
简称： HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKGPH Japannone规格： Oligopeptide
简称： VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMPPH 日本无规格：寡肽
缩写：VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMPPH 日本无规格：细胞外基质
缩写：rVN
玻连蛋白Thermo Fisher scientificA14700规格：细胞外基质
缩写：FN
纤连蛋白Sigma-AldrichF2006规格： 市售涂层材料
简称： Synthemax II
Synthemax IICorning3535规格： 聚合物
聚乙烯醇-co-itaconic acid日本 VAM &PovalAF-17规格：化学
戊二醛Sigma-AldrichG5882规格：化学
Na2SO4Sigma-Aldrich239313规格：化学
H2SO4Sigma-Aldrich339741规格：化学
缩写：EDC
N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐Sigma-AldrichE7750规格： 化学
简称：NHS
N-羟基琥珀酰亚胺Sigma-Aldrich56480规格：化学
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148规格：化学
Triton-X100Sigma-AldrichT8787规格： 细胞培养耗材
细胞刮刀Corning3008规格： 细胞培养耗材分散
酶 IISigma-AldrichSI-D4693规格： 细胞培养基
Essential 6Thermo Fisher scientificA1516401规格： 细胞培养基
Essential 8Thermo Fisher scientificA1517001规格： 细胞培养基
DMEM/F12Thermo Fisher scientific11330-032规格： 细胞培养基
DMEMThermo Fisher scientific12800-017规格： 细胞培养基
MCDB 201Sigma-AldrichM6770规格： ES cell
Human ES cellWiCell Research Institute， Inc..WA09规格： iPS细胞
人iPS细胞Riken Cell BankHS0077规格： 35 mm
简称： TCP
TCP dishCorning353001规格： 60 mm
简称： TCP
TCP dishCorning353002规格： 24 well dish
24 well dishCorning353047规格： Blocking剂
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA8806规格： 检测试剂
碱性磷酸酶活染色Thermo Fisher scientificA14353规格： 检测试剂
苏木精和伊红Sigma-Aldrich1.05175规格： EB 形成培养皿
6 孔超低附着培养皿Corning3471规格： 涂层材料
明胶Sigma-AldrichG9391规格： 涂层材料
MatrigelCorning354230规格： 小鼠
NOD-SCID 小鼠国家应用研究实验室无规格： 血清
胎牛血清生物工业04-001-1A规格： 抗生素
抗真菌性抗生素Thermo Fisher Scientific15240-062规格：
Nanog抗体 InvitrogenMA1-017规格：
SSEA4Abcamab16287规格：
OCT3/4 抗体InvitrogenPA5-27438规格：
Sox2Invitrogen48-1400规格：
平滑肌肌动蛋白InvitrogenPA5-19465规格：
AFPInvitrogenPA5-21004规格：抗体
GFAPInvitrogenMA5-15086规格：抗体
Alexa Fluor 555 – 偶联的山羊抗小鼠抗体InvitrogenA-21422规格： 抗体
Alexa Fluor 488 – 偶联山羊抗兔抗体InvitrogenA-11008规格： 抗体
剂 抗体 抗体抗体 抗体

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Higuchi, A., Ling, Q. D., Chang, Y., Hsu, S. T., Umezawa, A. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem. Rev. 113, 3297-3328 (2013).
  2. Higuchi, A., et al. Physical cues of cell culture materials lead the direction of differentiation lineages of pluripotent stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, 8032-8058 (2015).
    3. ....

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