长期活细胞成像评估细胞对紫杉醇处理的细胞命运响应

摘要

活细胞成像能够提供单个细胞或整个细胞群体的丰富信息，而这些信息仅通过固定细胞成像无法获得。本文描述了在使用抗有丝分裂药物紫杉醇处理后，通过活细胞成像技术评估细胞命运决定的实验方案。

摘要

活细胞成像是一种强大的技术，可用于在长时间内直接观察单个细胞中的生物学现象。在过去十年中，新兴且创新的技术显著提升了活细胞成像的实用性。如今，细胞可在维持37 °C和5% CO₂的细胞培养条件下保持聚焦并持续成像数天。此外，可同时获取代表不同实验条件的多个视野图像，从而提供高通量的实验数据。与固定细胞成像相比，活细胞成像具有显著优势，能够直接可视化并进行动态细胞事件的时间定量分析。活细胞成像还能识别单个细胞行为的差异，而这些差异在基于群体的检测中可能被忽略。本文中，我们描述了通过活细胞成像评估细胞在抗有丝分裂药物紫杉醇处理后命运决定的实验方案。我们展示了可视化有丝分裂阻滞细胞是直接从有丝分裂死亡还是滑脱回间期的方法。我们还介绍了如何利用基于荧光泛素化的细胞周期指示系统（FUCCI）来评估由有丝分裂滑脱产生的间期细胞中能够重新进入细胞周期的比例。最后，我们描述了一种用于识别核膜破裂事件的活细胞成像方法。

引言

抗有丝分裂药物长期以来已被用于多种实体瘤的化疗方案中，且通常表现出显著疗效^1,2,3。从作用机制上看，这些药物会破坏正常的有丝分裂进程，促使快速增殖的癌细胞发生有丝分裂阻滞。然而，细胞在有丝分裂阻滞后的命运具有高度变异性：一部分细胞会直接从有丝分裂期进入细胞死亡，而另一些细胞则会退出有丝分裂，以四倍体细胞的形式返回间期（该过程称为有丝分裂逃逸）^4,5,6,7,8。这些进入间期的细胞可能执行凋亡、发生永久性细胞周期阻滞，甚至重新进入细胞周期^4,5,6,7,8,

方案

本方案重点介绍使用非转化且染色体稳定的视网膜色素上皮（RPE-1）细胞系进行活细胞成像实验。然而，只要根据需要调整细胞培养条件，本方案也可适用于任何贴壁细胞系。所有操作必须遵守所在机构的生物安全、伦理准则及相关法规。

1. 活细胞成像前的细胞准备

1. 使用新鲜解冻且处于早期传代的表达人组蛋白H2B与荧光蛋白融合蛋白的RPE-1细胞（例如 H2B-GFP），或FUCCI系统（有关生成表达FUCCI细胞的详细实验方案可参见参考文献）⁴⁵以评估有丝分裂细胞命运。
   1. 为测量细胞核破裂的频率，使用表达 H2B-GFP 以及带有单个核定位信号的红色荧光蛋白串联二聚体（TDRFP-NLS）的 RPE-1 细胞。
      注意：三种绿色荧光蛋白串联融合至单一核定位信号的构建体（GFP₃-NLS) 也已被用于证明破裂现象（如参考文献所示）⁴²).
   2. 将细胞培养于10 cm组织培养皿中，使用适当的生长培养基。RPE-1细胞培养于不含酚红的达尔伯克改良伊格尔培养基/F-12营养混合物（DMEM:F12），并添加10%胎牛血清（FBS）、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。
2. 吸弃细胞培....

结果

采用上述方案，对表达 H2B-GFP 的 RPE-1 细胞用抗有丝分裂药物或对照溶剂（DMSO）处理，并通过活细胞成像进行分析。分析结果显示，100% 的对照组有丝分裂 RPE-1 细胞在进入有丝分裂后平均 22 分钟启动后期（图 1A，1D）。相比之下，经紫杉醇处理的 RPE-1 细胞表现出显著的有丝分裂阻滞，持续数小时（图 1D）。成像结果显示，48% 的有丝分裂阻滞细胞发生了有丝分裂期细胞死亡（图 1B，1E），而其余 52% 的细胞则发生了有丝分裂逃逸（图 1C，1E）。

为评估经历有丝分裂滑脱的RPE-1细.......

讨论

长期活细胞成像最关键的方面是确保被成像细胞的健康状态。必须尽量减少细胞暴露于各种额外的环境应激因素，例如温度、湿度和/或CO₂浓度的非理想条件。同时，限制荧光激发光照引起的光损伤也非常重要，因为已知成像过程中的光照应激会影响细胞行为⁵⁰。限制光损伤可通过多种方式实现，具体方法在其他文献中有详细描述⁴⁸。通常情况下，最佳策略是使用最短的曝光时间，以获得足够明亮的荧光信号，从而有效追踪细胞，进而降低光毒性。然而，如果细胞每10–20分钟才成像一次，则通常可以耐受较长的曝光时间（接近像素饱和水平），尽管这一参数需针对每种荧光染料和细胞类型通过实验确定。由于被成像的细胞对环境和成像相关的应激均敏感，在活细胞成像实验中必须始终设置对照细胞，并对其进行监测，以确认其增殖行为正常。

长期活细胞成像的一个局限性在于，需要为现有显微镜配备能够维持温度和5%加湿CO₂环境的培养箱，或配备同样可维持适当温度和气体环境的载台式培养室。虽然持续通入CO₂

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无酚红DMEM:F12培养基	Hyclone	SH3027202
10% 胎牛血清（FBS）	Gibco	10438026
100 IU/mL 青霉素和100 mg/mL 链霉素	Gibco	15070063
PBS	Gibco	10010049
0.25% 胰蛋白酶/EDTA	Gemini	50-753-3104
12孔玻璃底成像培养皿	Cellvis	P12-1.5H-N
紫杉醇	TSZ Chem	RS036
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	NC0215085
环境培养室	In Vivo Scientific
5% CO2	Airgas	Z03NI7432000201
15 mL 圆锥形离心管	Fisherbrand	05-539-12
10 cm 聚苯乙烯组织培养板	Falcon	08772E
10 mL 一次性移液管	Fisherbrand	4488
5804R 15安培离心机	Eppendorf	97007-370
1000 微升移液器	Gilson	Pipetman Classic
20 微升移液器	Gilson	Pipetman Classic
p1000 移液器吸头	Sharp	p1126
p20 移液器吸头	Sharp	P1121
RPE-1 细胞	ATCC	CRL-4000
Galaxy 170S 培养箱	Eppendorf	CO17011005
Pipette Boy 移液辅助器	Integra	156401
血细胞计数板	Fisher Scientific	0267110
用于活细胞成像的Nikon Ti-E-PFS倒置显微镜	Micro Video Instruments, Inc.	MEA53100
Prior X-Y 载物台系统与白光LED照明器	Micro Video Instruments, Inc.	500-H117P1N4
带编码器的Prior Proscan 3 XYZ控制器	Micro Video Instruments, Inc.	500-H31XYZE
Andor 数字相机	Micro Video Instruments, Inc.	D10NLC
Nikon NIS Elements AR 软件	Micro Video Instruments, Inc.	MQS31000
用于荧光成像的SOLA LED照明器	Micro Video Instruments, Inc.	SOLA-E
带CO2流量控制的InVivo环境培养室	Micro Video Instruments, Inc.	Ti-IVS-100
Ti-ND6-PFS 电动物镜转盘（完美聚焦系统）	Micro Video Instruments, Inc.	MEP59391
Ti-C 系统聚光镜转盘	Micro Video Instruments, Inc.	MEL51000
用于系统聚光镜转盘的Ti-C LWD长工作距离镜头组件	Micro Video Instruments, Inc.	MEL56200
Te-C LWD Ph1 模块	Micro Video Instruments, Inc.	MEH41100
CFI Plan Fluor DLL 10X 物镜，数值孔径0.3，工作距离16 mm	Micro Video Instruments, Inc.	MRH10101
CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM 物镜	Micro Video Instruments, Inc.	MRH48230