抗生物質耐性の進化でマルチコピー プラスミドの役割をテストするための実験方法をご紹介します。
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この記事について
サマリー
要約
マルチコピー プラスミドは原核生物に非常に多いが、細菌の進化におけるそれらの役割のままかり。我々 は最近、マルチコピー プラスミッドによって指定されたセルあたり遺伝子コピー数の増加がプラスミド エンコード遺伝子の進化を加速させる可能性を示した。この作品は、マルチコピー プラスミドの遺伝子の進化を促進するための能力をテストする実験システムを提案する.分子生物学の単純なメソッドを使用して、抗生物質耐性遺伝子を大腸菌MG1655、染色体またはマルチコピー プラスミド上に挿入できるモデル システムを構築しました。抗生物質の濃度の増加の下で異なる系統を反映する実験的進化のアプローチを使用して、我々 は時間をかけて細菌集団の生存率を測定します。抗生物質分子と抵抗性遺伝子の選択は、遺伝子突然変異の買収を通じて抵抗を与えることができるだけので、です。この「進化レスキュー」アプローチは、マルチコピー プラスミドの抗生物質抵抗性の獲得を促進するための可能性をテストする簡単な方法を提供します。実験システムの次のステップでは、抗生物質耐性の分子基盤が特徴です。抗生物質耐性の獲得のための責任の突然変異を識別するために、我々 は全体の人口とクローンから得られた試料のディープの DNA シーケンス使用します。最後に、調査の下で遺伝子の変異の役割を確認する我々 は親の背景にそれらを再構築し、結果系統の抵抗の表現型をテストします。
概要
細菌の抗生の抵抗は重大な健康問題1です。基本的なレベルで病原細菌の抗生物質耐性の普及、自然淘汰の2,の3による進化の単純な例です。簡単に言えば、抗生物質の使用は、耐性菌の選択を生成します。進化生物学の重要な問題は、したがって、抗生物質への耐性を進化する細菌集団の能力に影響を与える要因を理解します。選択の実験は、細菌の進化生物学を調査するための非常に強力なツールとして浮上しているし、このフィールドは幅広い進化問題4,5,6に信じられないほどの洞察力を生産しています。実験的進化の 1 つの親株から開始された細菌集団が定義され、厳しく管理された条件の下で連続継代します。これらの文化の成長中に発生する突然変異のいくつかの増加細菌のフィットネス、これらは自然淘汰によって文化を介して 。実験では、人口のサンプルは非進化する冷凍化石レコードを作成する定期的に低温保持されます。細菌集団を進化を特徴付けるためのアプローチの広い数を使用できますが、2 つの最も一般的な方法は、フィットネスの試金、遠い祖先と全ゲノム配列が進化した細菌の競争力を測定ドライブの適応の遺伝の変更を識別するために使用されます。リチ....
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プロトコル
1. 抗生物質耐性遺伝子を符号化実験システムの構築
注: ここで大腸菌MG1655 プラスミッドまたは染色体符号化された抗生物質耐性遺伝子の受信者のひずみとして使用されていた。抗生物質耐性遺伝子は、染色体またはマルチコピー プラスミッドそれ以外同質遺伝子系統 (図 1) にエンコードされます。
-
MG1655 の染色体の λ のバクテリオファージの統合サイト (attB)20の抗生物質耐性遺伝子の挿入。
- Pcr 法による染色体attBサイトの両側に 500 bp 長い領域を増幅します。YbhC F のオリゴヌクレオチドを使用して (5'-CCTGTACCGTACAGAGTAAT-3')、attB R (5'-GCCCGCCACCCTCCGGGCCGGTATAAAAAAGCAGGCTTCA-3') 左相同領域、attB F (5'-AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTATACTAACTTGAGCGAAA-3') と YbhB/R (5'-TGGCGATAATATTTCACCGC-3') 右の 1 つ。プライマー Tem1-pBAD-F を使用してblaTEM 1抵抗性遺伝子の増幅 (5'-TGAAG....
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結果
筆者らは, β-ラクタマーゼ遺伝子blaTEM 1第 3 世代セファロスポリン セフタジジム12耐性に向けて進化を調べた。この遺伝子は、 blaTEM 1の変異がセフタジジム29などのセファロスポリンを分解する TEM 1 の活動の範囲を拡大することができます TEM 1 セフタジジムに抵抗を与えないがので選ばれました。Β-ラクタマーゼなど修正の酵素の活動の彼らの範囲の変化につながるアミノ配糖体抗生物質耐性酵素の変異は、一般的な29,30です。本実験系は酵素のこのタイプの進化の観光に便利です。このプロトコルを次の巧妙な実験の詳細なレポート サン ミジャンらを参照してください。201612。
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ディスカッション
分子生物学、実験進化マルチコピー プラスミド細菌の抗生物質耐性の進化の役割を調べるために考案ディープの DNA シーケンスを組み合わせた新しいプロトコルを提案します。このプロトコルは、さまざまな分野からの技術を結合がそれを開発するために必要なすべての方法は単純であり通常の微生物学実験室で実行することができます。プロトコルの最も重要な手順は、モデル システム系統の建設および突然変異の実験進化後に観察された (これは、正確な同じ方法を使用して実行されます) の改造におそらくです。ただし、等温アセンブリ システム21、大幅簡素化されこのプロトコル分子生物学の経験の中間レベルを持つユーザーが実装できるようにします。
プロトコルの別の重要なステップは、抗生物質の濃度の増加の下で実験的進化です。例として、このプロトコルは ¼-1/8 系統と毎日抗生物質濃度倍増のマイクの実験を開始します。ただし、抗生物質の変更率が低いは、絶滅26から進化の救助のチャンスを高めることができます。したがって、抗生物質の濃.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品はセルバンテス デによって支えられたサラッド カルロス III (計画アジア デ私 + D + 私 2013-2016): CIBER (CB06/02/0053)、PI16-00860 CP15 00012 協調融資欧州開発地域基金 'ヨーロッパを達成する方法' を付与 (ERDF)。在マドリード (2016-T1/バイオ-1105) と私の地域の政府のAtracción ・ デ ・ タレントプログラムに支えられて + スペイン Ministerio デ Economía、インドゥストリア y Competitividad (BIO2017-85056-P) の D Excelencia です。ASM セルバンテス ・ デ ・からミゲル サーブレット交わりに支えられてサラッド カルロス 3 世 (MS15/00012) の欧州社会基金の協調融資「あなたの未来への投資」(ESF) と ERDF。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| サーモサイクラー | BioRad | C1000 | |
| エレクトロポレーター | BiorRad | 1652660 | |
| エレクトロポレーションキュベット | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| NanoDrop 2000/2000c | サーモフィッシャーサイエンティフィック | ND-2000 | 吸光度260nm/280nmおよび260nm/230nmの比を測定するDNA品質を測定 |
| インキュベータ | メモリ | UF1060 | |
| インキュベーター(シェーカー) | Cole-Parmer Ltd | SI500 | |
| 電気泳動電源 | BioRad | 1645070 | アガロースゲル電気泳動 |
| 電気泳動チャンバー | BioRad | 1704405 | アガロースゲル電気泳動 |
| Pippettes | Biohit | 725020, 725050, 725060, 725070 | |
| マルチチャンネルピペット | Biohit | 728220、728230、 728240 | |
| プレートリーダー Synergy HTX | BioTek | BTS1LF | |
| 接種ループ | Sigma-Aldrich | I8388 | |
| 96ウェルプレート | Falcon | 351172 | |
| LB | BD Difco | DF0446-17-3 | |
| LB 寒天 | フィッシャー科学 | BP1425-500 | |
| Phusionポリメラーゼ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | F533S | |
| ギブソンアセンブリ | ニューイングランドバイオラボ | E2611S | |
| レストリクション酵素 | フェルメンタス FastDigest | ||
| 抗生物質 | シグマ・アルドリッチ | ||
| QIAprep スピン ミニプレップキット | キアゲン | 27104 | プラスミド抽出キット |
| ウィザード ゲノムDNA精製キット | プロメガ | A1120 | gDNA 抽出キット |
| DNeasy Blood &ティッシュキット | Qiagen | 69506 | gDNA抽出キット |
| エレクトロポレーションキュベット | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| ペトリ皿 | Sigma-Aldrich | D9054 | |
| クライオチューブ | ClearLine | 390701 | |
| 96ウェルプレート (-80ºC ストレージ) | Thermo Fisher Scientific | 249945 | |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | DNA concentartion |
| Agarose | BioRad | 1613100 | Agarose gel electrophoresis |
| 50x TAE buffer | BioRad | 1610743 | Agarose gel electrophoresis |
| T4 Polynucleotide Kinase | Thermo Fisher Scientific | EK0031 | |
| T4 DNAリガーゼ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | EL0014 |
参考文献
- Neill, J. TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS. Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).
- Palmer, A. C., Kishony, R. Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance. Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).
- M....
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再版と許可
