ويصف هذا البروتوكول طريقة سهلة ومريحة التسمية ووضع تصور للكروموزومات الحية في الخلايا الانقسامية باستخدام تسمية 2.0 باكمام Histone2B-التجارة والنقل ونظام الفحص المجهري [كنفوكل] قرص غزل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصوير الخلايا الحية لفصل الكروموسومات أثناء الانقسام
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الكروموسومات يجب موثوق بها وموحدة عزلهم في خلايا ابنه أثناء انقسام الخلية الانقسامية. ويسيطر الإخلاص لفصل الكروموسومات الآليات المتعددة التي تشمل تفتيش الجمعية المغزل (SAC). الكيس هو جزء من نظام التغذية المرتدة المعقدة التي المسؤولة عن منع تقدم الخلية عن طريق الانقسام ما لم تعلق جميع كينيتوتشوريس الصبغية على مغزل microtubules. الصبغية متخلفة وكروموسوم الشاذ العزل مؤشرا من نقاط التفتيش لمراقبة دورة الخلية المفككة، ويمكن استخدامها لقياس استقرار الجينوم تقسيم الخلايا. يمكن أن يؤدي إلغاء الضوابط التنظيمية للكيس في تحول الخلية العادية إلى خلية خبيثة من خلال تراكم الأخطاء أثناء فصل الكروموسومات. تنفيذ الكيس وتشكيل kinetochore معقدة محكم وينظم التفاعلات بين مؤنزم والفوسفاتيز مثل 2A "الفوسفاتيز البروتين" (PP2A). ويصف هذا البروتوكول تصوير الخلية الحية المتخلفة الكروموسومات في الخلايا الليفية الجنينية الماوس المعزولة من الفئران التي كانت بالضربة قاضية فرعية تنظيمية PP2A-B56γ. هذا الأسلوب ويتغلب على أوجه القصور في دورة الخلية تحكم التصوير تقنيات أخرى مثل التدفق الخلوي أو إيمونوسيتوتشيميستري التي لا توفر سوى لقطة مركز سيتوكينيسيس الخلية، بدلاً من تصور الزمانية المكانية دينامية من الكروموسومات وخلال الانقسام.
المقدمة
في بروتوكول التالية، ويصف لنا طريقة ملائمة لتصور فصل الكروموسومات والانقسامية التقدم خلال دورة الخلية في الخلايا الليفية الجنينية الماوس استخدام هيستون 2B-التجارة والنقل، ووسم باكمام 2.0 وتصوير الخلايا الحية.
رصد الفصل كروموسوم نقاط التفتيش لمراقبة دورة الخلية وتلعب دوراً هاما في الحفاظ على سلامة الوراثية من الخلية2،،من 13. تراكم الكروموسومات سوء منفصلة يمكن أن تؤدي إلى انيوبلويدي، ومن السمات مميزة ل الأورام الأكثر صلابة 4. ومن ثم، يمكن استخدام الكشف المتخلفة الكروموسومات كأسلوب لدراسة كروموسومية عدم الاستقرار.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت جميع التجارب التي أجريت في هذه الدراسات وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام مرفق بحوث الغذاء والدواء (FDA).
1-العزلة وثقافة الليفية الجنينية الماوس (ميفس)
- عزل الماوس الليفية الجنينية (ميفس) من سلالة PP2A-B56γ-ماوس ونوع البرية ليتيرماتيس عن طريق بروتوكول قياسي 7،،من89.
- اكسباندميفس للممرات 3، تجميد وتخزين حتى حاجة لتجارب 8.
2-تثقيف Mefs في الزجاج غطاء غرف 2-جيدا للعيش التصوير
- إعداد 500 مل وسائط النمو MEF تتضمن "دولبيكو تعد....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ميفس من نوع البرية والفئران--PP2A--B56γ المصنفة في زجاج غطاء دائرة 2-جيدا ويسمح بإرفاق. في اليوم الثاني، كانت متزامنة MEFs استخدام 0.1% FBS ح 24. في يوم 3، ميفس في وسائل الإعلام مع 200 نانوغرام/مل نوكودازولي و 30 "قدرة شرائية" CL-غبطة ريجينتويري المحتضنة ح 18 في 37درجة مئوية و 5% CO2. في يوم 4، تم تصويرها الخلايا استخدام مجهر [كنفوكل] قرص نظام غزل (الشكل 1). يعيش خلية التصوير استخدمت لتصور مصير الخلايا الفردية كما أنها تقدم من نيبد عن طر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نقاط التفتيش لمراقبة دورة الخلية التي تضمن الفصل كروموسوم دقيق منع انيوبلويدي وخلية التحول 1،،من23. في هذه الدراسة، وجدنا أن المنظمة من PP2A-B56γ أدت إلى نقطة تفتيش الجمعية مغزل ضعف. تصوير الخلايا الحية سمح لنا بمراقبة العزل سوء الصبغية خلال الانقسام في "ميفس" PP2A B56γ التعامل مع نوكودازولي 9.
هذا البروتوكول يستخدم تسمية Histone2B-التجارة والنقل الناتجة عن التكنولوجيا باكمام 2.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
شكر وتقدير
ونود أن نشكر الدكتور كيوان قوة هونغ والدكتور بهاراتكومار جوشي على التعليقات القيمة التي تحسن المخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| DMEM / F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (100X) | Gibco | 11140050 | |
| البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco ' s فوسفات مخزن محلول ملحي | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| مصل الأبقار الجنيني | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| صناديق تخزين قارورة مبردة | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| قوارير مبردة | Corning / | costar 431416 | |
| قوارير T75 | Cellstar | 658175 | |
| 2 غطاء زجاجي بغرفة جيدة | Nunc | 155380PK | |
| مقياس الخلية الرؤية ملف تعريف خلية | Nexcelom Bioscience LLC | مقياس السيلومتر الرؤية ثلاثي | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| CellLight Histone 2B-GFP ، BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific Inc. | C10594 | |
| Zeiss Cell Observer نظام المجهر متحد البؤر القرص الغزل | كارل زايس المجهر | Zeiss Cell Observer SD | |
| حمام مائي | علمي حراري | 280 سلسلة | |
| حاضنة | Sanyo الحلول التجارية | MCO-18AIC (UV) | |
| خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية | شركة بيكر | SterilGard | |
| برنامج Axiovision | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| برنامج ImageJ | المعهد الوطني للصحة | الإصدار 1.51r |
المراجع
- Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression. Dev Cell. 39, 638-652 (2016).
- Etemad, B., Kops, G. J. Attachment issues: kinetochore transformations and s....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
