يصف لنا بروتوكول مفصل للمقايسة الطفرة الاتحاد "حدد أمداً" في الخلايا المستزرعة من القوارض المعدلة وراثيا أو الحيوانات المقابلة تعامل مع عامل الكيماوية/الفيزيائية للفائدة. وقد استخدمت هذا النهج على نطاق واسع لاختبار المحدثة للطفرات من المواد المسببة للسرطان في خلايا الثدييات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
قد وضعت عددا من النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا ونظم الكشف عن الطفرات المحدثة للطفرات في اختبار للمواد المسببة للسرطان في خلايا الثدييات. هذه، استخدمت الفئران المعدلة وراثيا و "لامدا" (λ) حدد الاتحاد "نظام الكشف عن الطفرات" للتجارب المحدثة للطفرات بالعديد من المجموعات البحثية في جميع أنحاء العالم. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل للمقايسة الطفرة الاتحاد "حدد أمداً"، التي يمكن تطبيقها على الخلايا المزروعة من الفئران المعدلة وراثيا/الفئران أو معاملة الحيوانات المقابلة مع وكيل الكيماوية/الفيزيائية للفائدة. البروتوكول يتكون من الخطوات التالية: (1) عزل الحمض النووي من الخلايا أو الأجهزة/الأنسجة من الحيوانات المحورة وراثيا تعامل في المختبر أو في الجسم الحي، على التوالي، مع مجمع اختبار؛ (2) استعادة ناقل المكوكية لامدا تحمل جين مراسل حيث (أي، التحوير الاتحاد ) من الحمض النووي الجينوم؛ (3) التعبئة والتغليف لناقلات المرض الذين تم إنقاذهم إلى bacteriophages المعدية؛ (4) إصابة بكتيريا المضيفة واستزراع تحت شروط انتقائية للسماح بنشر الطفرات المستحثة الاتحاد ؛ وسجل (5) الاتحاد-طفرات والحمض النووي تسلسل التحليل لتحديد تواتر متحولة الاتحاد والطيف الطفرة، على التوالي.
المقدمة
وضعت مجموعة واسعة من النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا ونظم الكشف عن الطفرات المحدثة للطفرات في اختبار للمواد المسببة للسرطان في خلايا الثدييات. من هذه الفئران "الأزرق الكبير" (المشار إليها أدناه ك BB) المعدلة وراثيا و λ حدد الاتحاد "نظام الكشف عن الطفرات" قد استخدمت للتجارب المحدثة للطفرات بهذه المجموعة والعديد من غيرها بحوث المجموعات في جميع أنحاء العالم1،2، 3،4،5،،من67،،من8
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-الحمض النووي في معزل عن الخلايا الليفية الجنينية الماوس
ملاحظة: الليفية الجنينية الماوس الأساسي يتم عزل من الأجنة المستمدة من الفئران المحورة وراثيا BB مع الخلفية الوراثية C57BL/6، وفقا للبروتوكول المنشورة53. انطلاق المواد لهذا البروتوكول يتكون من 1 × 106 و 1 × 107 تنتجها الخلايا الليفية الجنينية الخلايا تعامل مع اختبار تحكم مركب مقابل . حصاد والعد من هذه الخلايا باستخدام الأساليب القياسية موصوفة في المراجع10،،من5455.
- إعداد المخزن المؤقت (0.3 M السكروز 60 ملم بوكل، 15 ملم كلوريد الص....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
اعتماداً على توزيع البيانات، يتم استخدام اختبارات حدودي أو غير حدودي تحديد أهمية الاختلاف في التردد متحولة الاتحاد بين المجموعات المعالجة والمراقبة (أيفعل مقابل الترددات متحولة عفوية) . يتم إجراء مقارنة الترددات متحولة المستحث الاتحاد عبر مجموعات معاملة مختلفة بشتى (العشوائية) الاختبارات الإحصائية، حسب الاقتضاء. اختبار الهندسة الفوقية آدامز وسكوبيك يستخدم عادة لمقارنة أطياف الطفرات المستحثة وعفوية العام57، على الرغم من أن الاختبارات الأخر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يتم استخدام الفحص حدد الاتحاد λ للكشف عن الطفرات في التحوير الاتحاد ضبطت المجينية الحمض النووي للخلايا المشتقة من الأجهزة/أنسجة القوارض BB3. جينوم هذه الحيوانات المحورة وراثيا يحتوي على نسخ متعددة جنبا إلى جنب ناقل المكوك λLIZ تشروموسومالي المتكاملة، الذي يحمل الاتحاد (294 bp) وﻻسي (1,080 bp) المتسلسلات، ك الجينات مراسل حيث1، 2 , 25-مقايسة حدد الاتحاد λ يستند إ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
كافة الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نود أن نعترف بالمساهمات من جميع الزملاء والمتعاونين لدراساتنا الأصلي، أحيلت نتائجه في هذه المخطوطة (لأغراض توضيحية). دعم عمل المؤلفين من المنح المقدمة من المعهد الوطني لطب الأسنان والبحوث إحضارهما "المعاهد الوطنية للصحة" (1R01DE026043) على أساسها، ومن جامعة California Tobacco-Related برنامج بحوث الأمراض إلى AB ( TRDRP-26IR-0015) وشارع (تردرب-25IP-0001). وكان مقدمو الدراسة أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليل البيانات، وتفسير البيانات وكتابة التقرير، أو في قرار يقدم للنشر.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أجار | مو الحيوية ، وشركة | 12112-05 | بكتريولوجية |
| الصف BigDye Terminator v3.1 دورة تسلسل كيت | ثيرمو فيشر العلمي | 4337455 | لا شيء |
| الكازين الببتون | ألفا إيسار | H26557 | لا شيء |
| الجيلاتين | جي تي بيكر | 2124-01 | مسحوق |
| الجلسرين | فيشر العلمي | BP 229-1 / M-13750 | لا شيء |
| LB أجار | فيشر العلمية | BP 9724-500 | لا شيء |
| QIAquick PCR طقم تنقية | Qiagen | 8104 | 50 تفاعلات تنقية PCR |
| أسيتات الصوديوم ثلاثي هيدرات | فيشر Scientific | M-15756 | لا |
| شيء < م > Taq5000 < / em > DNA Polymerase ؛ | Qiagen | 201207 | none |
| الثيامين هيدروكلوريد | ماكرون للكيماويات الدقيقة | 2722-57 | لا شيء |
| Transpack Packaging Extract | Stratagene Corp. ، المكتسبة من قبل BioReliance | شركة سيجما ألدريتش | 200223 | 50 تفاعل تغليف |
| تريس بيس | فيشر Scientific | BP 152-1 / EC 201-064-4 | لا شيء |
| Trypton | Biosciences | RC-110 | لا شيء |
المراجع
- Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
- Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
استكشف المزيد من المقالات
