Biz Lambda seçin CII mutasyon tahlil transgenik kemirgenler kültürlü hücrelerdeki veya faiz kimyasal/fiziksel ajanı ile tedavi karşılık gelen hayvanlar için detaylı bir protokol tanımlamak. Bu yaklaşım yaygın kanserojen memeli hücreleri, mutagenisitesinin test etmek için kullanılmıştır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Lambda seçin CII mutasyon tespit sistemi
Bu makalede
Özet
Özet
Transgenik hayvan modelleri ve mutasyon tespit sistemleri bir dizi memeli hücreleri kanserojen mutagenisitesinin test için geliştirilmiştir. Bunlar transgenik fareler ve Lambda (λ) Select CII mutasyon tespit sistemi mutagenisitesinin deneyler için birçok araştırma grupları tarafından dünya çapında istihdam edilmiştir. Burada, biz transgenik fareler/fareler kültürlü hücrelere uygulanan Lambda seçin CII mutasyon tahlil için detaylı bir protokol tanımlamak veya faiz kimyasal/fiziksel Aracısı ile ilgili hayvan tedavi. Protokol aşağıdaki adımlardan oluşur: (1) yalıtım hücrelerden genomik DNA'ın veya organ/Transjenik hayvanlar dokuların vitro veya vivo içindesırasıyla, bir test karışımla; tedavi (2) (Yani, CII transgene) mutational muhabir gen genomik DNA taşıyan lambda Servisi vektör kurtarılması; (3) bulaşıcı bacteriophages içine kurtarıldı vektörlerin ambalaj; (4) bir ana bilgisayar bakteri hastalık ve seçici koşullar altında indüklenen CII mutasyonlar yayılmasını sağlamak için kültür; ve (5) skorlama CII-mutantlar ve DNA dizi mutasyon spektrum ve CII mutant sıklığı sırasıyla belirlemek için analizi.
Giriş
Transgenik hayvan modelleri ve mutasyon tespit sistemleri geniş bir memeli hücreleri kanserojen mutagenisitesinin test için geliştirilmiştir. Bunlar transgenik Big Blue (bundan sonra BB adlandırılır) fareler ve λ Select CII mutasyon tespit sistemi mutagenisitesinin deneyler için bu grup ve birçok diğer araştırma grupları dünya çapında1,2tarafından istihdam edilmiştir, 3,4,5,6,7,8,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. fare embriyonik fibroblastlar genomik DNA izolasyonu
Not: Birincil fare embriyonik fibroblastlar göre yayımlanmış protokolü53C57BL/6 genetik arka plan ile BB transgenik fareler türetilen embriyo etkilenmezsiniz. Bu iletişim kuralı için başlangıç materyali 1 x 106 -bileşik karşı test denetimi ile tedavi 1 x 107 embriyonik fibroblast hücreleri oluşur. Hasat ve standart yöntemlerle bu hücrelerin sayma başvurular10,54,55açıklanmıştır.
- Hazırlamak bir (0,3 M Sükroz, 60 mM KCl, 15 mM NaCl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Veri dağıtımı bağlı olarak, parametrik ya da non-parametrik testler (spontan mutant Frekanslar karşı indüklenenYani) tedavi ve kontrol grupları arasında CII mutant frekans farkı önemini belirlemek için kullanılır . İndüklenen CII mutant frekansları farklı tedavi grupları arasında karşılaştırılması yapılmış çeşitli tarafından (ikili) uygulanabilir istatistiksel testler. χ2 test veya Varyans analizi (ANOVA), gibi diğer testler de sıklığını karşılaştırma.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
λ Select CII tahlil organ/dokulardan BB kemirgenler3türetilmiş hücre genomik DNA kurtarıldı CII transgene mutasyonların tespiti için kullanılır. Bu Transjenik hayvanlar genom CII taşıdığı genetik entegre λLIZ Servisi vektör, birden çok tandem kopyalarını içerir (294 bp) ve lacI (1,080 bp) transgenes, mutational muhabir gen1, 2 , 25. λ Select CII tahlil genomik .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Tüm yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.
Teşekkürler
Tüm meslektaşlarımızın katkıları ve ortak çalışanlar, sonuçlar için bu el yazması (görsel amacıyla) sevk edilmiştir orijinal çalışmalarımız için kabul etmek istiyoruz. Yazarların iş hibe Ulusal Enstitüsü diş ve ulusal sağlık Enstitüleri (1R01DE026043) AB için kraniyofasiyal araştırma ve California Tobacco-Related hastalığı araştırma programı için AB (Üniversitesi tarafından desteklenmektedir TRDRP-26IR-0015) ve ST (TRDRP-25IP-0001). Sponsorlar çalışmanın çalışma tasarım, veri toplama, veri analizi, veri yorumu, rapor yazma veya yayın için göndermek için karar herhangi bir rolü yoktu.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ağar | MO Biyo Laboratuvarları A.Ş. | 12112-05 | Bakteriyolojik sınıf |
| BigDye Terminator v3.1 Döngü Sıralama Kiti | Thermo Fisher Scientific | 4337455 | Yok |
| Kazein Pepton | Alfa Aesar | H26557 | Yok |
| Jelatin | JT Baker | 2124-01 | Toz |
| Gliserol | Fisher Scientific | BP 229-1 / M-13750 | Yok |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP 9724-500 | Yok |
| QIAquick PCR saflaştırma kiti | Qiagen | 8104 | 50 PCR saflaştırma reaksiyonları |
| Sodyum Asetat Trihidrat | Fisher Scientific | M-15756 | Hiçbiri |
| Taq5000 DNA Polimeraz | Qiagen | 201207 | Yok |
| Tiamin Hidroklorür | Macron İnce Kimyasallar | 2722-57 | Yok |
| Transpack Ambalaj Özü | Stratagene Corp., BioReliance Tarafından Satın Alındı | Sigma-Aldrich A.Ş. | 200223 | 50 paketleme reaksiyonu |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP 152-1 / EC 201-064-4 | Yok |
| Trypton | Biosciences | RC-110 | Yok |
Kaynaklar
- Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
- Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
