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方法文章

腺相关病毒介导的 CRISPR 心脏基因编辑在小鼠中的应用

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DOI：

10.3791/57560

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2018年8月2日

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, Davis Heart and Lung Research Institute, Biomedical Sciences Graduate Program, Biophysics Graduate Program, Ohio State University Wexner Medical Center

本文内容

摘要

在此，我们提供了一项详细的实验方案，用于执行 体内 利用重组腺相关病毒（rAAV）介导的CRISPR递送系统在小鼠中进行心脏基因编辑。该方案为治疗杜氏肌营养不良症相关的心肌病提供了一种有前景的治疗策略，也可用于在出生后小鼠中构建心脏特异性的基因敲除模型。

摘要

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统极大地促进了多种物种的培养细胞及活体生物的基因组编辑。CRISPR 技术还被探索用于多种人类疾病的新型治疗手段。概念验证数据令人鼓舞，例如近期研究利用小鼠模型证明了基于基因编辑的治疗策略在杜氏肌营养不良症（DMD）中的可行性和有效性。特别是，通过静脉注射和腹腔注射重组腺相关病毒血清型 rh.74（rAAVrh.74），可实现将编辑工具高效递送至心脏 金黄色葡萄球菌 CRISPR 相关蛋白 9（SaCas9）及两种引导 RNA（gRNA），用于删除小鼠 23 号外显子中带有突变密码子的基因组区域 Dmd 基因。当gRNA被设计为靶向目的基因的编码区时，该方法也可用于敲除目的基因，并研究其在出生后小鼠中的心脏功能。在本方案中，我们详细展示了如何构建rAAVrh.74-CRISPR载体，以及如何在新生小鼠中实现高效的心脏递送。

引言

成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）技术代表了基因组编辑领域的最新进展，彻底改变了细胞和生物体遗传学研究的现状。基于CRISPR的基因组编辑利用单导向RNA（gRNA）引导CRISPR相关内切酶（如CRISPR相关蛋白9（Cas9）和Cpf1）靶向基因组DNA上的特定序列，该序列与gRNA编码的原间隔序列互补，并在其侧翼含特定的原间隔序列邻近基序（PAM）1,2。PAM序列因Cas9或Cpf1基因来源的细菌种类不同而有所差异。目前最常用的Cas9核酸酶来源于Streptococcus pyogenes（SpCas9），其识别的PAM序列为NGG，位于基因组DNA靶序列下游的非靶链上。在靶位点处，Cas9和Cpf1蛋白会引发双链断裂（DSB），随后通过细胞固有的DNA修复机制进行修复，主要包括非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）通路3,4。在缺乏同源重组模板的情况下，DSB主要通过易错的NHEJ通路修复，可能导致核苷酸的插入或缺失（indels），若DSB发生在基因的编码区，则可能引起移码突变5,6。因此，CRISPR系统已被广泛用于在多种细胞....

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方案

本方案中使用的动物饲养于俄亥俄州立大学实验动物资源中心，符合动物使用指南的要求。所有动物实验均经俄亥俄州立大学机构动物护理、使用与审查委员会批准。

1. 将gRNA设计并克隆至CRISPR载体

  1. 选择两个靶向 dystrophin 基因第20内含子和第23内含子（i20 和 i23）的 gRNA，用于 SaCas9：i20：5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT 以及 i23：5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT （PAM序列已用下划线标出并以斜体显示）。
    注意：i20 和 i23 的靶位点相距约 23 千碱基对（kbp）。为破坏一个编码基因，建议使用两个靶向共有外显子的 gRNA，其 PAM 序列为 SaCas9 识别的 NNGRRT（优先选择 NNGAAT、NNGGGT 和 NNGAGT），且两个靶点间距在 20 kbp 以内。
  2. 使用以下PCR参数在1×退火缓冲液（5×退火缓冲液储备液含0.5 mol/L K-乙酸盐、150 mmol/L HEPES-KOH、10 mmol/L Mg-乙酸盐，pH 7.4）中退火gRNA寡核苷酸（100 µmol/L）：95 °C 10 min，90个循环的95至59 °C，每循环降低0.4 °C，持续20 s；90个循环的59至32 °C，每循环降低0.3 °C，持续20 s；20个循环的32至2....

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结果

在将gRNAs包装入rAAV用于体内研究之前，应先在细胞培养中评估其诱导靶向基因组DNA区域缺失的效率。为此，将gRNAs与表达SaCas9的载体通过电穿孔法转入C2C12细胞，并利用跨越靶位点的引物通过PCR分析基因组DNA图1PCR产物约为500 bp表明目标基因组DNA已被成功删除，这是基因编辑成功的标志；而对照细胞由于基因组DNA片段较大，不应产生扩增条带。

在细胞培养中确认gRNA的有效性后，可利用三质粒共转染AAV293细胞的方法，将gRNA包装至rAAVrh.74或其他血清型（如AAV6、AAV8或AAV9，这些血清型均表现出高效的心脏基因递送能力）中。我们发现，无需分别为两种gRNA制备两个独立的rAAV，而是将两种gRNA载体以等摩尔比例混合，制备单一的rAAV制剂。rAAV病毒颗粒通过密度梯度超速离心法进行纯化，并通过SDS-PAGE分析其纯度。高度纯化的rAAV制剂在SD.......

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讨论

在本方案中，我们详细说明了实现所需目标的全部必要步骤 体内 利用rAAVrh.74介导SaCas9和两条gRNA递送系统对出生后小鼠进行心脏基因编辑。如前所述，该方法可用于恢复肌营养不良小鼠中抗肌萎缩蛋白的表达，具体操作详见我们的研究工作27但也可实现对小鼠心脏相关基因的快速反向遗传学研究，而无需经历传统基因敲除方法中生成和繁育基因敲除小鼠模型的漫长过程。

为了在目标组织中实现高效的基因编辑，需注意以下几个关键步骤：1）需使用适当的细胞系验证SaCas9/gRNA诱导靶向基因组DNA缺失的有效性；2）选择能够介导高水平基因转导至目标组织的合适AAV血清型至关重要；3）确定AAV载体向目标组织进行基因转移的最佳递送途径。

在本方案中，设计的 SaCas9/gRNA 被包装到 AAVrh.74 中，而非先前报道的 AAV8 和 AAV9，用于编辑 Dmd 基因12,

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致谢

R.H. 获得美国国立卫生研究院基金（R01HL116546 和 R01 AR064241）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 555 山羊抗兔 IgGThermo Fisher ScientificA-21428
苯并核酸酶（Benzonase Nuclease）Sigma-AldrichE1014
生物安全柜Thermo Fisher Scientific13471300 系列 A2 型 II 级生物安全柜
BsaINew England BioLabs IncRO535S
感受态细胞Agilent Technologies200314
细胞培养皿，150 mmNest Scientific USA715001
冷冻切片机Leica BiosystemsLeica CM3050S
DMEMThermo Fisher ScientificMT10017CVCorning cellgro
抗肌萎缩蛋白抗体（Dystrophin antibody）Spring BioscienceE2660
Fast-Ion Midi 质粒提取试剂盒IBI ScientificIB47111
FBSThermo Fisher Scientific26-140-079
滤器单元，0.45μmThermo Fisher Scientific166-0045
GoTaq 预混液PromegaM7122
高容量质粒小量提取试剂盒IBI ScientificIB47102
马血清Abcamab139501
Isotemp 2239 水浴锅Thermo Fisher Scientific15-460-11Q
Isotemp 加热块Thermo Fisher Scientific11-718
倒置共聚焦显微镜Carl Zeiss Microscopy, LLCLSM 780
LightCycler 480 实时荧光定量 PCR 仪Roche5015243001LightCycler 480 Instrument II
大容量离心机Thermo Fisher Scientific46-910Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus
微量离心机Thermo Fisher Scientific75002445Sorvall Legend Micro 21R
Nanodrop 分光光度计Thermo ScientificND2000CLAPTOPNanoDrop™ 2000/2000c
i20-F 引物Integrated DNA TechnologiesCACCgGGCGT
TGAAATTCTCATTAC
i20-R 引物Integrated DNA TechnologiesAAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;
i23-F 引物Integrated DNA TechnologiesCACCgCACCGATGAGAGGG
AAAGGTC
i23-R 引物Integrated DNA TechnologiesGACCTTTCCCTCTCATCGGTGc
引物（Oligos）Integrated DNA Technologies
OptiPrep 密度梯度介质Sigma-AldrichD1556-250ML
OptiMEMThermo Fisher Scientific31985070
PEG8000Sigma-Aldrich89510-1kg-F
聚乙烯亚胺（Polyethylenimine）Polysciences23966
蛋白酶 K（Proteinase K）Sigma-AldrichP2308
Quick-Seal 离心管Beckman Coulter Inc342414
QIAquick 凝胶回收试剂盒Qiagen28704
Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR 试剂盒Alkali ScientificQS2005
RevertAid RT 反转录试剂盒Thermo Fisher ScientificK1691
转子Beckman Coulter Inc33792270Ti 型
T4 DNA 连接酶New England BioLabs IncM0202S
PCR 仪Bio-rad1861096
TRIzol 试剂Thermo Fisher Scientific15596026
超速离心机Beckman Coulter Inc8043-30-1192Optima le-80k
超滤离心管MilliporeSigmaUFC510096
含 DAPI 的 VECTASHIELD 封片剂Vector Laboratories, IncH-1200

参考文献

  1. Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).
  2. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163, 759-771 (2015).
  3. Cong, L.,....

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重印与许可

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