このプロトコルでは、体外で合成ペプチド a β オリゴマーを準備しドット解析をしみが付くことによって a β オリゴマーの相対量を評価する方法について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
Β アミロイド (a β) は集計に自己組み立てるに本質的な傾向と疎水性ペプチドです。各種骨材の中で a β オリゴマーはアルツハイマー病 (AD) の進行中の主要な神経毒として広く受け入れられている、AD の発症に重要なイベントであると見なされます。したがって、a β オリゴマー阻害剤が神経変性を防ぐため、疾患修飾として開発される可能性を秘めている AD の治療。しかし、a β オリゴマーの異なる形成プロトコルは、異なる特性を持つオリゴマーに可能性があります。さらに、効果的に画面 a β1-42オリゴマー阻害する多くの方法がないです。A11 抗体は逆平行 β シート構造を持つ有毒な a β1-42のオリゴマーのサブセットと反応できます。このプロトコルでは、合成 a β1-42ペプチド体外から A11 正 a β1-42オリゴマーの豊富なサンプルを準備し、ドットのしみが付くことによってサンプルの A11 正 a β1-42のオリゴマーの相対量を評価する方法について述べるA11 と a β1-42を用いた解析-特定 6E10 抗体。このプロトコルを使用して、A11 正 a β1-42のオリゴマーの阻害剤は、半定量的な実験結果から上映されることができます。
概要
アルツハイマー病 (AD) は、高齢者の世界的な1に影響を与える最も重要な神経変性疾患の一つです。Β アミロイド (a β) の異常凝集が広告の主要な病理要因かもしれないことが広く受け入れられます。A β の凝集体は、老人斑、AD 患者の脳の生物学的マーカーの 1 つの主要なコンポーネントです。さらに、特に、オリゴマーを含めて、a β の集計は、AD の進行性神経細胞死の原因かもしれない強力な毒性を作成します。したがって、a β オリゴマー形成の抑制、神経変性を妨げる可能性し、a β オリゴマー阻害剤は、疾患修飾として開発される可能性 AD の治療。多くの研究は、オリゴマー体外を形成、人工の a β オリゴマーの構造と形態を探検し、調査を使用して生体外モデル2,3 a β オリゴマーの阻害剤を合成 a β ペプチドを使用しています。,4します。 しかし、a β オリゴマー形成プロトコル別の in vitroの異なる研究グループ間で比類のない結果が生じる別の形態学的特性を持つオリゴマーに 。したがって、a β オリゴマーの形成の標準的なプロトコルが急務します。
今までは、a β オリゴマーが直....
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プロトコル
1. ソリューションの準備
注: は、試薬ソースの材料表を参照してください。
- 5% ウシ血清アルブミン (BSA) ソリューションを準備するには、二重蒸留水 100 mL に BSA の 5 g を追加します。ボルテックスによってそれらを完全にミックスします。1 ヶ月の 4 ° C でソリューションを保存します。
- 5 %bsa 溶液 10 mL に抗体原液の 10 μ L の追加によって反オリゴマー抗体 A11 溶液 (1:1, 000) を準備します。ボルテックスによってそれらを完全にミックスします。1 ヶ月の 4 ° C でソリューションを保存します。
- 抗 a β 抗体 6E10 溶液 (1:1, 000) を準備するには、5 %bsa 溶液 10 mL に抗体原液の 10 μ L を追加します。ボルテックスでは、完全にそれらをミックスします。1 ヶ月の 4 ° C でソリューションを保存します。
- アンチ維オリゴマー抗体 OC 溶液 (1:1, 000) を準備するには、5 %bsa 溶液 10 mL に抗体原液の 10 μ L を追加します。ボルテックスでは、完全にそれらをミックスします。1 ヶ月の 4 ° C でソリューションを保存します。
- 二重蒸留水 1,000 mL に 24 g のトリス基地と NaCl の 88 g を追加するこ....
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結果
A β1-42の単量体が準備の後 a β1-42オリゴマーを形成できるかどうかを調べるには、TEM 分析を使用しました。HFIP 溶解 a β1-42モノマー サンプル (図 1A) で表示される集計は認められなかった。また、周りの直径を持つ主に球状骨材 10 80 nm で観察された a β1-42サンプルの振動、48 時間後 a β1-42の準備 (図 1B) 後オリゴマーを形成することを示唆しています。
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ディスカッション
このプロトコルでは a β1-42のオリゴマーを含む試料を準備する分析をしみが付くことのドットで A11 正 a β1-42のオリゴマーの量を分析する方法を報告しています。A β1-42オリゴマーの豊富なサンプルの準備のための私たちの方法はかなりシンプルで、信頼性と再現性のある、まだ気づかれるべきいくつかのポイントがあります。まず、HFIP、合成 a β1-42ペプチドを溶解するために使用されます。集計の a β1-42ペプチドを HFIP ソリューション中のモノマーに分解することができます。しかし、HFIP は揮発しやすい、HFIP の粘度が非常に低い。したがって、HFIP に a β1-42ペプチドを溶解する必要があります、HFIP ソリューションは検体操作中に HFIP の潜在的な損失を減らすためにできるだけ早くする必要があります。また、ピペット チップをこの手順で正確な分注を確実に遮断。第二に、純度の高い窒素ガスを使用して、ソリューションから HFIP を蒸発します。この中に、a β1-4.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品は、国家自然科学基金、中国の (U1503223、81673407、21475131)、浙江省の非営利技術 (2016 C 37110)、寧波国際科学技術に関する応用研究プロジェクトからの補助金によって支えられました。協力プロジェクト (2014 D 10019)、生命科学と健康 (2015 C 110026)、寧波科学技術プロジェクト共通の富 (2017 C 50042) オフイオチューカンあご・ ケネス ・李海洋バイオ医薬品開発基金李 Dak 合計イップ ・寧波市革新チーム・寧波大学 k. c. ウォン マグナ基金。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers) | Abcam | GR91739-58 | |
| 6E10 (β-Amyloid Rabbit Ab) | セル シグナル技術 | 2454S | |
| OC (抗アミロイド線維OC抗体) | ミリポア | AB2286 | |
| 西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)マーカーヤギ抗ウサギIgG(H + L) | Beyotime | A0208 | |
| Aβ1-42 | GL Biochem | 52487 | |
| 1,1,1,3,3,3,3-ヘキサフィウオロ-2-プロパノール | アラジン | I1523078 | |
| クルクミン | Σ | C1386 | |
| アルブミン ウシ V | Solarbio | A8020 | |
| 塩化ナトリウム | Sangon Biotech | D920BA0003 | |
| ドデシル硫酸ナトリウム | SCR | 30166428 | |
| TRIS | Solarbio | T8060 | |
| グリシン | Solarbio | G8200 | |
| ジメチルスルホキシド | Solarbio | D8370 | |
| 5×非変性ゲル PAGE タンパク質マーカー | Beyotime | P0016 | |
| Genshare CFAS anyKD PAGE | Genshare | JC-PE022 | |
| 純ニトロセルロースブロッティング膜 | Pall Corporation | T50189 | |
| メタノール | SCR | 10014118 | |
| エタノール | SCR | 10009218 | |
| 超低範囲 タンパク質 | マーカーSolarbio | PR1300 | |
| トランスファーメンブレン | Immobilon-PSQ | ISEQ00010 | |
| BeyoECL | スターBeyotime | P0018A | |
| Commassie Blue 高速染色液 | Beyotime | P0017 | |
| すべて - 自動化学発光イメージングシステム | タノン | タノン5200 | |
| 画像J | National衛生 | ||
| 画像処理ソフト | Adobe | Photoshop CS6 | |
| 磁気攪拌機 | 上海湖熙 |
参考文献
- Lauren, J. Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).
- De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70. Biophysical Journal. 112 (3), 444(2017).
- Di Scal....
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再版と許可
