本文描述了一种研究5-氨基乙酰丙酸介导的光动力疗法（ALA-PDT）对微生物抗菌作用的实验方案 金黄色葡萄球菌 生物膜。该方案可用于开发一种 体外 为将来研究光动力疗法（PDT）治疗细菌生物膜提供模型。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
一个 体外 研究5-氨基乙酰丙酸介导的光动力疗法作用的模型 金黄色葡萄球菌 生物膜
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
金黄色葡萄球菌 (S. aureus是一种常见的人类病原体，可引起化脓性和全身性感染。 S. aureus 感染难以根除不仅因为耐药菌株的出现，还因其能够形成生物膜。近年来，光动力疗法（PDT）被认为是一种控制生物膜感染的潜在治疗手段。然而，仍需进一步研究以加深对其作用机制及其对细菌生物膜影响的理解。本文描述了一种 体外 5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）光动力疗法模型，其中5-ALA是实际光敏剂原卟啉IX（PpIX）的前体。简言之，成熟 S. aureus 生物膜经ALA孵育后暴露于光照。随后，评估ALA-PDT的抗菌效果 S. aureus 通过计算菌落形成单位（CFUs）对生物膜进行定量，并通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结合活/死荧光染色进行可视化观察。代表性结果表明，ALA-PDT对细菌具有显著的抗菌作用 S. aureus 生物膜。该方案简单，可用于开发一种 体外 研究治疗的模型 S. aureus 使用ALA-PDT处理生物膜。未来，该方法也可在使用其他光敏剂针对不同细菌菌株的PDT研究中，经少量调整后加以参考。
引言
S. aureus 是一种重要的革兰氏阳性病原菌，可定植于人类宿主的皮肤和黏膜。其形成生物膜的能力被认为是其致病过程中的一个重要方面1。细菌生物膜是由细菌群体及其自身分泌的胞外聚合物基质共同构成的微环境，该基质包含多糖、DNA 和蛋白质等成分。这种基质在细菌感染的持续存在中发挥着关键作用，导致细菌对人类免疫系统以及现有的抗菌治疗手段具有高度耐受性2。目前，抗生素仍是治疗生物膜感染的主要手段，但其对生物膜的作用效果有限。已有研究表明，生物膜中的细菌细胞对抗生素的耐受性比浮游状态下的同类细胞高出 10 至 1,000 倍3。因此，亟需开发替代策略以应对这一难题。
光动力疗法（PDT）是一种治疗细菌感染的替代方法，其利用适当波长的光激活光敏剂，从而产生活性氧（ROS）。活性氧可通过破坏细胞壁、使酶失活以及损伤DNA，对靶细胞产生致死作用4。这种多靶点作用特性使得细菌难以对PDT治疗产生耐药性。
光动力疗法（PDT）对细菌和真菌生物膜的抗菌作用已在此前的研究中得到探讨，所使用的多种光敏剂包括亚甲苯蓝、孔雀石绿、亚甲蓝、氯素e6和卟啉类5,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 生物膜形成
- 在96孔微孔板中形成生物膜
- 取出保存在-80 °C的金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌株USA300以及3株形成生物膜的临床菌株（C1 - C3）。
注：临床菌株形成生物膜的能力已通过先前描述的微量滴定板法测定15。 - 将细菌接种于5 mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基中，在37 °C条件下振荡培养过夜至稳定期。
- 在25 °C下以4,000 x g离心过夜培养的细菌10分钟，弃去上清液。将菌体沉淀重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，最终浓度为2.0 x 109 CFU/mL。
注：细菌浓度通过测量光密度估算，并进一步通过平板计数法确定16，结果显示悬浮液中1 OD600相当于1.5 x 108 CFU/mL。 - 将细菌悬液用含0.5%葡萄糖的TSB培养基稀释1:200（即1.0 x 107 CFU/mL）。向经细胞培养处理的聚苯乙烯96孔微孔板的每孔中加入200 µL细菌悬液。
- 将微孔板在37 °C静置培养24小时，置于充分供氧的环境中。
注：不同细菌菌株形成成熟生物膜所需的培养时间可能有所不同；应在光....
- 取出保存在-80 °C的金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌株USA300以及3株形成生物膜的临床菌株（C1 - C3）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
与对照组（ALA-LED-、ALA+LED- 和 ALA-LED+）相比，ALA-PDT 处理后，USA300 及三种临床菌株的生物膜中细菌活力均有所下降图1).
为了验证菌落形成单位（CFU）实验的结果，并观察5-氨基酮戊酸光动力疗法（ALA-PDT）对细菌的抗菌作用 S. aureus 生物膜 原位，使用CLSM结合活性染色对USA300生物膜进行可视化观察。活菌和死菌分别被染成绿色和红色荧光。图像显示，生物膜中的大部分细菌被ALA-PDT杀灭，这与CFU测定结果一致图2).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
光动力疗法（PDT）自100多年前被发明以来，已作为一种癌症治疗手段得到了广泛研究18。在过去十年中，PDT已被用作一种抗菌策略，并对某些耐药性致病菌表现出治疗效果12。与浮游状态相比，细菌生物膜对抗生素治疗表现出更强的耐药性3，而ALA-PDT对生物膜的作用效果尚未得到充分研究。
在本文中，一个 体外 ALA-PDT 系统被描述，并且该模型对此的抗菌效果 S. aureus 生物膜的效果已得到证实。采用两种方法来检测ALA-PDT对 S. aureus 本方案中的生物膜。CFU检测通过计算处理后存活细胞数量来评估抗菌效果，而利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行的荧光活死染色不仅验证了CFU检测的结果，还检测了活菌与死菌的形态特征。 原位结合使用这两种分析技术是确定ALA-PDT对生物膜作用效果的理想方法。根据CLSM结果，死亡的细菌细胞主要分布在上层，而底层的部分.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
本工作由国家自然科学基金青年项目（编号 81300810）、上海市青年医生培养计划（编号 20141057）以及国家自然科学基金（81671982、81271791 和 81571955）资助。我们感谢 LetPub（www.letpub.com）在本论文撰写过程中提供的语言协助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB） | OXOID | CM0129B | |
| 胰蛋白胨大豆琼脂（TSA） | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | LIVE/DEAD BacLight 细菌活性检测试剂盒 |
| 碘化丙啶（PI） | Thermo Fisher Scientific | L7012 | LIVE/DEAD BacLight 细菌活性检测试剂盒 |
| 胰酶 | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| 5-氨基乙酰丙酸（ALA） | 复旦张江生物医药 | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus 菌株 USA300 | / | / | USA 300 来源参考文献：“Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”。 |
| Staphylococcus aureus 临床菌株（C1-C3） | / | / | 所有临床菌株均分离自复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉头颈外科收治的慢性鼻窦炎患者 [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, 等. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]。 |
| 96孔微孔板 | Corning Inc | 3599 | 透明平底聚苯乙烯组织培养处理微孔板，独立包装，带盖，无菌 |
| Fluorodish | NEST 生物科技 | 801001 | 玻璃底，无热原 |
| Eppendorf Safe-Lock 离心管，1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf 微型离心机 5417 | Eppendorf | Z365998 | SIGMA | |
| 培养箱 | Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 台式轨道摇床 |
| 发光二极管（LED） | 武汉雅阁光电技术有限公司 | LED-IB | |
| Leica TCS SP8 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica Microsystems | ||
| Leica LAS AF 软件 | Leica Microsystems | ||
| IMARIS 软件 | Bitplane |
参考文献
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
- Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
- Mah, T. F., O'Toole, G. A.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
