يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل الخلايا الدبقية المعوي من سوبموكوسا والصفيحة بروبريا الماوس الكبار

13.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/57629

⸱

أغسطس 15, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine-Gastroenterology, University of Michigan, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, 3Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Michigan, 4Department of Gastrointestinal Surgery, The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, 5Division of Gastroenterology, University of Arizona College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

وهنا يصف لنا عزل الخلايا المعوية الدبقية من الأمعاء سوبموكوسا استخدام متسلسلة يدتا إينكوبيشنز يخلب الكاتيونات ديفالينت والحضانة في الخلية غير الانزيمية حل الاسترداد ثم. تصفيح تعليق الخلية الناتجة في بولي-د-يسين و laminin النتائج في ثقافة مخصب بدرجة عالية من الخلايا الدبقية سوبموكوسال للتحليل الوظيفي.

الملخص

الجهاز العصبي المعوي (ENS) يتكون من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية المعوي (اجكس) الموجودة داخل الجدار العضلات الملساء وسوبموكوسا وبروبريا الصفيحة. اجكس تلعب أدواراً هامة في التوازن الغريزي عن طريق الإفراج عن مختلف العوامل التغذوية، ويسهم في سلامة الحاجز الظهارية. معظم الدراسات الأولية الثقافات الدبقية المعوي استخدام الخلايا المعزولة من الضفيرة myenteric بعد الانفصال الانزيمية. هنا، يتم وصف أسلوب غير الانزيمية لعزل والثقافة اجكس من سوبموكوسا المعوية والصفيحة بروبريا. بعد الإزالة اليدوية لطبقة العضلات الطولية، تم تحرير اجكس من الصفيحة بروبريا وسوبموكوسا باستخدام إينكوبيشنز يدتا مخزنة حبيس متسلسلة تليها الحضانة في حل الاسترداد المتوفرة تجارياً الخلية غير الانزيمية. إينكوبيشنز يدتا كانت كافية لتجريد معظم المخاطية الظهارية من بروبريا الصفيحة، مما يتيح حل الاسترداد خلية لتحرير اجكس submucosal. تم تجاهل أي بقايا الصفيحة بروبريا والعضلات الملساء جنبا إلى جنب مع إطلاق مينتيريك. وحددت اجكس بسهولة بقدرتها على التعبير عن البروتين حمضية فيبريلاري الدبقية (توصيني). فقط حوالي 50% تعليق خلية الواردة توصيني + الخلايا بعد إكمال إينكوبيشنز الأنسجة وقبل الطلاء على الركازة بولي-د-يسين/لامينين. ومع ذلك، بعد 3 أيام من استزراع الخلايا في معامل نيوروتروفيك المستمدة من الخلايا الدبقية (جدنف)-التي تحتوي على وسائط الثقافة، السكان خلية التمسك بلوحات المغلفة بالركيزة تتألف من > إطلاق المعوي 95%. قمنا بإنشاء خط الفأر هجين بتربية ماوس هجفاب-لجنة المساواة العرقية إلى خط مراسل تدتوماتو روزا لتعقب النسبة المئوية توصيني + الخلايا باستخدام صف الخلية الذاتية. وهكذا، يمكن عزلة بواسطة أساليب غير الانزيمية إطلاق المعوية غير مينتيريك ومثقف لمدة 5 أيام على الأقل.

المقدمة

الفائدة في وظيفة الخلايا الدبقية المعوي (اجكس) يزداد باطراد بسبب أدوارها المعترف بها في القناة الهضمية النزاهة والتوازن1،2. وباﻹضافة إلى ذلك، اجكس تختلف باختلاف مواقعها على طول غي المسالك3،4. اجكس الإفراج عن مختلف العوامل التغذوية، بما في ذلك عامل نيوروتروفيك المستمدة من الخلايا الدبقية (جدنف)، والمساهمة في القناة الهضمية حركية1،5 والرد على تركات الميكروبية6،7. وقد بينت الدراسات أن السكان الغانية غير متجانسة وأن وظيفتها تختلف تبعاً لما إذا كانت هي سوبموكوسال أو الموجودة ضمن ال1،الضفيرة مينتيريك7. على سبيل المثال، تسهم اجكس داخل سوبموكوسا تقاطعات ضيق8. وربطت التفاضلية التعبير توصيني والفسفره في اجكس لمرض باركنسون، مما يوحي باحتمال وجود صلة للنمط الظاهري القناة الهضمية من هذا الاضطراب9. في الآونة الأخيرة، لوحظ أن فقدان مينين البروتين النووي في ثقافات منعزلة من اجكس من سوبموكوسا المعوية الدانية كافية للحث على التعبير عن هرمون جاسترين10. كنتيجة لذلك، اقترح أن اجكس قد يكون منشأ الإثناعشرية gastrinomas، نوع من ورم الغدد الصم العصبية10. جماعياً، وهذه الأمثلة تؤكد أهمية دراسة السلوك ووظيفة اجكس معزولة في اضطرابات الأعصاب والسرطان11.

ويظل التحدي هو في المجال كيفية عزل ودراسة أحد أو كلا الغانية السكان في المختبر. النسب تتبع التجارب أثبتت أن اجكس في سوبموكوسا والصفيحة بروبريا تنشأ من خلايا السلف في ضفيرة مينتيريك7. على الرغم من أن هناك عدة بروتوكولات العزلة المنشورة المتاحة لتوليد ثقافات myenteric اجكس12،13،،من1415،،من1617، 18،19، لا تستهدف على وجه التحديد عزلة السكان الغانية بروبريا submucosal/الصفيحة. على وجه التحديد استخدام البروتوكولات القائمة لعزل الغانية مزيجاً من فصل الميكانيكية أو ميكروديسيكشن للعضلات الملساء جنبا إلى جنب مع تفكك الانزيمية، في نهاية المطاف التخلص من طبقة الخلايا المخاطية.

والهدف من هذه المخطوطة إظهار الخطوات لعزل غير انزيماتيكالي اجكس الأولية من بروبريا الصفيحة للدراسات في المختبر . نظراً لوجود لا علامات على وجه التحديد التمييز بين اجكس myenteric من تلك الموجودة في سوبموكوسا، استغلت الفصل المكاني بين المخاطية الظهارية من العضلات الملساء لعزل اجكس submucosal. وبالإضافة إلى ذلك، عن طريق الجمع بين أدتا استخلاب مع الانفصال غير الانزيمية، عزلت اجكس عن submucosa خلافا للعضلات الملساء، قد تم تجاهلها جنبا إلى جنب مع اجكس myenteric جملة المرتبطة بها. حدث آخر فصل سوبموكوسا واجكس بروبريا الصفيحة باستزراع الخلايا على ركائز الصديقة للخلية الدبقية، مثلاً، بولي-د-يسين ولامينين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وافق جميع التجارب على الحيوانات ووصف اللجنة جامعة ميتشغان في استخدام ورعاية الحيوانات.

1-إعداد العقيمة بولي-د-يسين (PDL) وحلول لامينين

  1. يوم واحد على الأقل قبل عزل الخلية، إعداد لوحات laminin المغلفة وبولي-د-يسين (PDL).
    ملاحظة: تم إعداد لوحات 6-جيدا وكذلك 12 تبعاً لأهداف تجريبية. عادة، تستخدم لوحات 12-جيدا للتحليل الكمي باستخدام البقع الغربية؛ في حين، واستخدمت لوحات 6-جيدا لعقد يعقم كوفيرسليبس (العقيمة) إيمونوهيستوتشيميستري. واستخدمت لوحات 24-جيدا للثقافة اجكس لل Ca2 + الجريان التصوير.
  2. تمييع حلول الأسهم مع الصف عالي النقاوة زراعة الأنسجة، خالية من الدناز والمياه خالية من رناسي في غطاء زراعة الأنسجة مع تصفية هيبا الهواء.
  3. تعقيم الزجاج كوفيرسليبس
    1. عقد ساترة مع ملقط معقم وتزج كوفيرسليبس في كوب إيثانول 100% للسماح الإيثانول تتبخر في هود زراعة الأنسجة ومن ثم ضع في لوحات 6-جيدا 15 دقيقة.
    2. بدلاً من ذلك، ضع كوفيرسليبس عدة على حدة على ورق نشاف سميكة 2 مم في حاوية بلاستيكية ثم اﻷوتوكﻻف.

2-طلاء ألواح

ملاحظة: هذه الخطوات تحت غطاء الاندفاق الصفحي زراعة الأنسجة عقيمة.

  1. تحسن الأسهم PDL 1 ملغ/مل وتمييع 01:10 مع المياه الصف زراعة الأنسجة المعقمة، حيث يكون التركيز النهائي 100 ميكروغرام/مل. استخدام 2 مل كل بئر لمعطف لوحات جيدا 6، 1 مل لتغطية بئر واحدة من صفيحة 12-جيدا و 0.5 مل لبئر واحدة في لوحات 24-جيدا. تخزين PDL المخفف المتبقية في مختبرين 12 مل في-20 درجة مئوية.
  2. بعد السماح PDL معطف الآبار على الأقل 1 ح، إزالة PDL مع ماصة معقمة. السماح لوحات للهواء الجاف تماما تحت غطاء الاندفاق الصفحي زراعة الأنسجة.
    ملاحظة: بعد إزالة الحل PDL مع ماصة معقمة، فإنه يمكن استخدام مرتين أكثر في غضون أسبوع واحد بعد تمرير من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  3. تحسن الأسهم لامينين على الجليد لتجنب تكوين هلام.
    ملاحظة: لامينين غير مخفف يصبح صلبة عند درجة حرارة فوق 8 درجات مئوية.
  4. تمييع في لامينين الأسهم (0.5 ملغ/مل) 01:50 مع الفوسفات مخزنة المالحة (دببس العقيمة دولبيكو) للحصول على تركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل. تخزين laminin المخفف في مختبرين 12 مل في-20 درجة مئوية.
  5. إضافة laminin المخفف للآبار التي تحتوي على المجففة PDL. استخدم 1 مل لتغطية سطح 6-جيدا ومل 0.5 لتغطية الجزء السفلي من لوحات 12-جيدا. كوفيرسليبس، إضافة 400 ميليلتر من laminin المخفف إلى كوفيرسليبس لتحقيق التغطية السطحية.
  6. احتضان لوحات المغلفة في 37 درجة مئوية ح 2، إذا تم استخدام اللوحة في اليوم نفسه (طلاء سريع). إذا لم يكن كذلك، ختم اللوحات مع غلاف بلاستيكي، وتخزين بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (طلاء بطيء).
    ملاحظة: ختم أمر حاسم لتجنب التلوث والتجفيف.
  7. إزالة الحل لامينين بعناية مع ماصة لتجنب خدش السطح. تغسل برفق الآبار ثلاث مرات مع دببس العقيمة.
  8. إضافة وسائط النمو الدبقية كاملة لكل الخير والحفاظ على اللوحات في 37 درجة مئوية حتى على استعداد لإضافة تعليق الغانية.
    ملاحظة: يسين بولي-د و laminin مغلفة لوحات يمكن تخزينها لمدة 3 أيام في 4 درجات مئوية. معطف اللوحات قبل عدة أيام وثم تخزينها في 4 درجات مئوية، وتغسل اللوحات مع دببس العقيمة ثلاث مرات. إضافة 2 مل دببس العقيمة لكل بئر بعد الغسيل النهائي. ختم اللوحة مع بارافيلم ومخزن في 4 درجات مئوية. من الضروري التأكد من أن تجف لامينين لا.

3-إعداد حلول العزل

  1. إعداد الحل الانفصال يدتا/حبيس/دببس. 500 مل من الحل، استخدم دببس العقيمة (دون الكالسيوم والمغنيسيوم) لجعل حل نهائي يدتا حبيس و 5 ملم 10 ملم. لمل 490 من دببس، إضافة 5 مل م 1 حبيس المخزن المؤقت و 5 مل من 0.5 م يدتا الأسهم الحل. تخزين في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  2. تعد وسائل الإعلام استثارة الخلايا الدبقية باستخدام المواد الكيميائية المدرجة في الجدول 1.
  3. إعداد وسائط النمو الدبقية باستخدام الكواشف ترد في الجدول 2.
    ملاحظة: يمكن تخزين وسائط النمو الدبقية التي تحتوي على جدنف لمدة أسبوع واحد في 4 درجات مئوية.

4-إزالة الجزء المعوي

ملاحظة: سمح الفئران حرية الوصول إلى الغذاء والماء قبل يوثانيزيشن بأسلوب إسقاط isoflurane وإزالة جهازا حيويا. وقد استخدمت الفئران C57BL/6 أكبر من 8 أسابيع عمر. وقد استخدمت كلا الجنسين دون اختلافات ملحوظة في الإعداد.

  1. Euthanize الماوس مع جرعة زائدة من إيسوفلوراني ومكان ضعيف في علبة تشريح. دبوس في الأطراف وتعقيم البطن مع الإيثانول 70%. خيمة الجلد بالملقط ثم قم بفتح البطن مع المقص.
  2. رفع الكبد وتحديد القاصي المعدة/بواب. قم بإزالة 7 سم الأمعاء الدانية. كن حذراً لا للدموع الأمعاء.
  3. اضغط بواب مع الملقط أثناء القص بعيداً في مساريق.
    1. استخدام تشريح حادة مع الجزء الخلفي من مقص كشط البنكرياس ملتصقة بعيداً.
    2. ضع الجزء المعوية في دببس المثلج دون Ca2 + أو Mg2 + (الشكل 1A).
      ملاحظة: شرائح أخرى من الأمعاء أو القولون يمكن أيضا إزالتها باستخدام نفس الأسلوب.
  4. استخدام حقنه 5 أو 10 مل المرفقة بإبرة ز 20 نهاية حادة لطرد محتويات البراز مع الجليد الباردة دببس (الشكل 1B).
  5. تقسيم الأمعاء إلى شرائح 3 سم لإزالة العضلات الطولية باستخدام هذه التقنية في البداية وصف سميث et al. 12 والمعدلة في سونداريسان et al. 10.
    ملاحظة: تستخدم القطع المعوية من يصل إلى اثنين من الفئران كل 30 مل الحل العزلة حبيس/يدتا/دببس.
  6. قطع حوالي 4 سم لفصل عصا خشبية من طرف القطن. نقع عصا خشبية في دببس (الشكل 1).
  7. كشف أحد قطاعات الأمعاء بسلاسة على عصا ترطب (الشكل 2 أ-ج).
  8. إزالة مساريق ملتصقة لا تزال تعلق باستخدام إبرة الآنف الملقط (الشكل 2D).
  9. استخدام شفرة حلاقة نظيفة أو مشرط جعل نيكس طولية اثنين على طول الأمعاء حيث كان مساريق المرفقة (الشكل 2E).
    1. ويت نصيحة القطن مع دببس. فرك تلميح القطن ترطب طوليا على امتداد العضلات لتخفيف الضفيرة العضلية الطولية/مينتيريك (لممب). ثم حرك طرف القطن أفقياً ندف بعيداً لممب من العضلات دائرية على طول الجزء المعوية أثناء إزالة لممب.
    2. عقد غيض عصا بين الإبهام والسبابة حين استقرار الجزء بالإصبع الأوسط والرابع (الشكل 2 واو). عند الانتهاء، سيتم بسهولة تقشر لممب الجزء المعوية.
  10. تجاهل لممب جردت من الأنبوبة المعوية وتعلق على مسحه القطن إلا حصاد اجكس من الضفيرة myenteric هو المطلوب.
  11. استخدام شفرة حلاقة لأسلخ فتح الجزء المعوية طوليا لإزالة من عصا خشبية.
  12. تخزين الأنسجة المعوية جردت (غالباً الغشاء المخاطي وسوبموكوسا بالإضافة إلى العضلات دائرية) في دببس على الجليد. كرر الخطوات من 4، 4 – 4.11 حتى يتم إعداد جميع قطاعات الأمعاء.

5-إزالة الغشاء المخاطي طلائي

  1. قص الأمعاء إلى أجزاء أصغر من سم ~0.5 مع مقص جيد.
  2. وضع الأنسجة في أنبوب الطرد مركزي مخروطية عقيمة 50 مل تحتوي على 30 مل من المثلج يدتا/حبيس/دببس الحل.
  3. روك الحل التي تحتوي على الأنسجة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في يميل ~ 60 في الدقيقة.
  4. قبل ترطيب ماصة بلاستيكية 5 مل من بيبيتينج المخزن المؤقت يدتا/حبيس/دببس صعودا وهبوطاً مرة واحدة، ومن ثم استخدام ماصة ترطب قبل "الماصة؛" الأنسجة والمخزن المؤقت تعليق صعودا وهبوطاً (تريتوريشن) 20 مرة لإزاحة المخاطية الظهارية.
  5. جمع الأنسجة من حضانة يدتا بصب هذا الخليط من خلال مصفاة خلية نايلون 100 ميكرومتر. تجاهل عكر مملوءة بالأغشية المخاطية التدفق من خلال (الشكل 3).
  6. ضع الأنسجة الإبقاء المصفاة في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي جديدة تحتوي على 30 مل جليد الباردة يدتا/حبيس/دببس استخدام الملقط إبرة الآنف.
  7. تكرار في الحضانة يدتا/حبيس/دببس لمرة ثانية بواسطة هزاز الأنسجة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في ~ 60 يميل كل دقيقة لتجريد قبالة الأغشية المخاطية الظهارية إضافية.
  8. قبل ترطيب ماصة 5 مل مع المخزن المؤقت وثم "الماصة؛" تعليق الأنسجة صعودا وهبوطاً 20 مرة لإزاحة الخلايا المخاطية.
    ملاحظة: سوف تميل الأنسجة إلى التمسك داخل ماصة كما تتم إزالة أكثر من الظهارة.
  9. جمع الأنسجة بعد الحضانة الثانية بصب هذا الخليط من خلال مصفاة خلية نايلون 100 ميكرومتر وتجاهل التدفق من خلال. الثانية التدفق من خلال ينبغي أن تكون ملحوظة عكر أقل من الأول (الشكل 3).
  10. تكرار مسح إينكوبيشنز يدتا 10 دقيقة حتى يتم الحل تقريبا (حوالي 3 إلى 4 إينكوبيشنز تبعاً لكمية الأنسجة وفعالية تريتوريشن) (الشكل 3).

6-مجموعة من الخلايا الدبقية المعوي من الصفيحة بروبريا وسوبموكوسا

  1. نقل الأنسجة من مصفاة النايلون إلى أنبوب الطرد مركزي مخروطية 15 مل يحتوي على 5 مل حل الاسترداد الخلية المتاحة تجارياً والصخور لمدة 25 – 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  2. تريتوراتي برفق 10 العاشر لينأى بالخلايا الدبقية المعوي من بروبريا الصفيحة.
    1. التصفية من خلال عامل تصفية 40 ميكرومتر وجمع فيلتراتي في أنبوب 50 مل نظيفة.
    2. شطف الأنسجة على تصفية النايلون مع 1 مل دببس.
    3. تجاهل الأنسجة ونقل ~ 5 – 6 مل فيلتراتي إلى أنبوب الطرد مركزي مخروطية نظيفة 15 مل.
    4. تدور فيلتراتي في 2,000 س ز في دلو يتأرجح جهاز الطرد مركزي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  3. إعادة تعليق بيليه الذي يحتوي على الخلية الدبقية في 1 مل على الأقل من المخزن المؤقت لاستثارة بلطف بيبيتينج بيليه صعودا وهبوطاً مع تلميح ماصة 500 ميليلتر. تجنب إدخال الفقاعات.
    ملاحظة: ضبط حجم استثارة حسب الحاجة للعدد من الآبار ولوحات. على سبيل المثال، 1.2 مل للوح 6-بئر واحد؛ 2.4 مل لاثنين 6-جيدا لوحات؛ 2.4 مل للوح 12-بئر واحد.
  4. "الماصة؛" 200 ميليلتر من تعليق خلية في كل بئر ميليلتر 6-جيدا أو 100 لوحات PDL-laminin المغلفة 12-جيدا التي تحتوي على وسائط النمو الدبقية.
  5. عدم الإزعاج الأطباق بعد إضافة الخلايا إلى اللوحات ووضع في حاضنة 37 درجة مئوية للسماح بالحد الأقصى لعدد من الخلايا للانضمام.
    ملاحظة: سيتم إرفاق ضمن ح 6 – 8 إعداد خلايا صحية لكن انتظر 24 ساعة على الأقل قبل تغيير وسائط الإعلام بلطف بيبيتينج قبالة وسائل الإعلام جنبا إلى جنب مع الخلايا غير ملتصقة.
  6. استخدام الخلايا لإجراء تجارب عليها 3-4 أيام بعد وضعها في الثقافة (الشكل 4). إجراء تحليل إيمونوفلوريسسينت باستخدام الأجسام المضادة التي تهم علامات البروتين محددة (الجدول 3). على سبيل المثال، استخدمت هنا توصيني، و S100b و p75NTR أو Sox10. ﻫ-كادهيرين أو الأجسام المضادة للعضلات الملساء ألفا أكتين استخدمت لتقييم درجة التلوث من أنواع الخلايا الأخرى.

7-تلوين إيمونوفلوريسسينت

  1. نضح وسائط الإعلام إيقاف الثقافات وشطف مرتين مع برنامج تلفزيوني.
  2. إصلاح الثقافات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع بارافورمالدهيد 4%.
  3. إزالة مثبت وشطف ثم 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
  4. بيرميبيليزي الخلايا مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2% X-100 تريتون في درجة حرارة الغرفة.
  5. احتضان الخلايا بيرميبيليزيد مع حلول حظر يتألف من الدجاج لمكافحة IgY، أرنب المضادة أو الماوس المضادة مفتش ح 2 في درجة حرارة الغرفة.
  6. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها، مثلاً، توصيني (1:1، 000).
    1. شطف الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. إذا كان أداء كولوكاليزيشن المضي قدما إلى الخطوة 7.7.
  7. احتضان المجموعة التالية من الأجسام المضادة الأولية على الأقل 2 ح في درجة حرارة الغرفة، ولكن يفضل أن يكون ذلك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. استخدام إضعاف أرنب المضادة-S100 1: 1000 أو 1: 500 إضعاف الماوس المضادة-p75NTR.
    ملاحظة: يتم إضعاف جميع الأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني.
  8. شطف الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة الأجسام المضادة الأولية. ثم احتضان الخلايا مشطوف مع المناسبة معلم فلوريسسينتلي الثانوي الأجسام المضادة ح 2 في درجة حرارة الغرفة (الجدول 3).
  9. شطف 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة الأجسام المضادة الثانوية.
  10. جبل كوفيرسليبس على الشرائح باستخدام 1-2 قطرات من وسائل الإعلام المتزايدة مع DAPI وعرض الخلايا تحت مجهر فلوري.

8-التدفق الخلوي

  1. إزالة الخلايا الدبقية ملتصقة للتدفق الخلوي بدهن الخلايا مرة واحدة مع دببس ثم قم بإضافة 0.25% التربسين-يدتا في البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. احتضان الخلايا في حل التربسين-يدتا في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 3 إنهاء عملية الهضم عن طريق جمع الخلايا في الخلية الدبقية كاملة النمو وسائط الإعلام.
  2. جمع الخلايا من سينتريفوجينج في 400 x ز لمدة 5 دقائق، ومن ثم إعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني.
  3. إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4% لمدة 10 دقائق وثم بيرميبيليزي بنسبة 0.2 في المائة X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني كما هو موضح في "الخطوة 7، 4".
  4. كتلة الخلايا مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 1% جيش صرب البوسنة والمناعي أنسجة محددة 20 دقيقة، مثل الدجاج IgY (IgG) (H + L) (1:1، 000) من حمار المضادة أو حمار الماعز المضادة IgG (H + L) (1:1، 000).
  5. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية توصيني (1:2، 000)، ه-كادهيرين (1: 400)، والعضلات الملساء α أكتين (1: 500)، أو Pgp9.5 (1: 500) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  6. يغسل الجسم مع برنامج تلفزيوني.
    1. احتضان المجمع ضد مستضد مع الأضداد الموسومة فلوريسسينتلي الثانوية المحتضنة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    2. استخدام قاسمة منفصلة من الخلايا المحتضنة مع الجسم المضاد الثانوي ليكون بمثابة عنصر التحكم ايستب. كل السكان من الخلايا يتم غسلها وحراكه في برنامج تلفزيوني قبل التدفق الخلوي.
    3. تحليل السكان اثنين من الخلايا على سيتوميتير تدفق خلال النابضة على الخلايا الحية.

9-إعداد "الأنسجة الماوس" من هجفاب-Cre:tdTomato الفئران

ملاحظة: كدنا لوكس-توقف-لوكس-تدتوماتو هو أعرب من روزا موضع22،23 (مختبرات جاكسون، #007914) ويولد fluorescence الذاتية عندما ولدت لماوس معربا عن ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية (Cre-هجفاب). يتم إجراء تحليل في الموقع عن طريق إنشاء أقسام الأنسجة المجمدة.

  1. إصلاح الأنسجة المعوية في بارافورمالدهيد 4% ح 1 ويذوي ثم بين عشية وضحاها في السكروز 1 م في برنامج تلفزيوني.
  2. تضمين الأنسجة في تجارياً بشراء قطع الأمثل الأنسجة (OCT) مركب يتكون من 10% البولي فينيل الكحول و 4.2 في المائة البولي إيثيلين غليكول، والأداة ثم تجمد في النتروجين السائل.
  3. إعداد 5 ميكرومتر كريوسيكشنز ومن ثم تحميل باستخدام أنتيفادي تركيب وسائط مع DAPI.
  4. للتدفق الخلوي، إعداد اجكس من هجفاب-الفئران Cre:tdTomato+ كما هو موضح في الخطوات 4.1-6.5.
  5. تريبسينيزي الخلايا من اللوحة بعد 3 أيام في الثقافات كما هو الحال في "الخطوة 8، 1" ومن ثم إصلاحها لمدة 10 دقائق في بارافورمالدهيد 4%.
  6. تحليل الخلايا المعزولة من الفئران سلبية لجنة المساواة العرقية بالتوازي مع الخلايا المعزولة من هجفاب-الفئران Cre:tdTomato+ على سيتوميتير تدفق.
    ملاحظة: تم تشييد البوابات لتجنب الخلايا الميتة والحطام.

10-Ca2 + الجريان التصوير

  1. احتضان اجكس مطلي على لوحة 24-جيدا مع 3 ميكرومتر فلوو-4-صباحا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. صورة Ca2 + الإشارة في حل تم شراؤها تجارياً تيرودي استخدام مجهر [كنفوكل] قرص غزل وآثاره الطول موجي 480 نانومتر (F480) بعد إضافة الببتيد CCK أو جاسترين. وذكر تحليل الصور في سونداريسان et al. 10 .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

محضرات تعتبر ناجحة إذا لم تتقيد توصيني + الخلايا وتنتشر داخل ح 24 (الشكل 4 أ). تعذر تحديد عدد الخلايا الدبقية حتى بعد 24 ساعة عند الخلايا التقيد، وأظهرت الأدلة ينتشر في المجاميع مسطحة (الشكل 4 باء). الخلايا عند الحافة من المجموعات التي تميل إلى توسيع عمليات طويلة، وأعرب عن علامات الكلاسيكية الدبقية، مثلاً، توصيني، S100b و p75NTR (الشكل 4، 4 د)10<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

اجكس تلعب أدواراً هامة في التوازن القناة الهضمية، ومن الضروري أن عزل ودراستها في المختبر. في هذا البروتوكول، قدم طريقة بسيطة لعزل اجكس من بروبريا الصفيحة الأمعاء الماوس الكبار لدراسة وظيفة الدبقية المعوي.

إزالة مساريق ملتصقة ولممب مع مسحه القطن يزيل بعض من إطلاق إنتر-myenteric المقيمين بين العضلات الطولية والدائرية، ويزيد من إمكانية الوصول إلى المخازن المؤقتة إلى السطح سوبموكوسال ويزيل الكثير من الشعيرات الدموية أكبر . هذا الأخير يقلل من عدد خلايا الدم الحمراء تلويث الثقافات النهائي. ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

الكتاب أتمنى أن نعترف بدعم من DK045729 R37 (إلى جلم)، AR060837 R01 (إلى HX) وجامعة ميشيغان الجهاز الهضمي بحوث مركز الجزيئية الأساسية P30 DK034933.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بولي دي ليسين (مخزون 1 ملغم / مل)سيجماA-003-Eمخفف 1:10
لامينين (مخزون 0.5 مجم / مل)سيجماL4544مخفف إلى 10 & ميكرو; جم / مل على ICE
EDTA (0.5 م)Lonza51201تمييع 1: 100 في DPBS
HEPES (1 م)مخفف 36216004 Corning1: 100 في
محلول استعادة الخلاياDPBS Corning354253
محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS)HyCloneSH30028.02
DMEM / F-12Thermo Fisher Scientific11320033
البنسلين الستربتومايسين (100x)Life Technologies15140-122
Gentamicin (مخزون 50 مجم / مل)Life Technologies15750060
GDNF (10 & micro; مخزون ز)سيجماSRP3200
L-Glutamine (مخزون 200 مليمتر)Life Technologies25030-081
دجاج مضاد ل GFAPThermo Fisher ScientificPA1-10004
الماعز المضاد للعضلات المينة أكتين   ؛Abcamab112022
ماوس مضاد ل Pgp9.5 Novus BiologicalsNB600-1160
Goat anti-E-cadherin R & D أنظمةAF748
أرنب S100   ؛Abcamab34686
Mouse p75 NTR ميليبورMAB5592
أليكسا فلور 488 الماعز المضاد للدجاج IgYInvitrogenA-11039
Alexa Fluor 488 الحمار المضاد للماعز IgGInvitrogenA-11055
Alexa Fluor 568 الماعز المضاد للفأر IgGInvitrogenA-11004
Alexa Fluor 594 الحمار المضاد للأرانب IgGInvitrogenR-37119
إطالة الذهب المضاد للبهتان كاشف مع DAPIThermo Fisher ScientificP36931
Fungizone (Amphotericin B) 250 & micro; جم / ملLife Technologies15290-018
L-Fura-2-AMInvitrogenF-14201
CCK الببتيدAnaspec ، Fremont ، CAAS-20741
ببتيد Gastrin (Gastrin-17)Abbiotec ، Bloomington ، IN350188
مصفاة شبكة نايلون Celll (100 & micro ؛ م)فيشر ساينتفيك22363549
نايلون شبكة مصفاة (40 & micro; م)فيشر ساينتفيك22363547
ماصة مصلية يمكن التخلص منها 5 ملفيشر ساينتفيك13-678-11D
0.25٪ تربسين-EDTA (1x)تقنيات الحياة25200-056

المراجع

  1. Grubisic, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. Journal of Physiology. 595 (2), 557-570 (2017).
  2. Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (11), 625-632 (2012).
  3. Rao, M., et al. Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice. Gastroenterology. 153 (4), 1068-1081 (2017).
  4. Rao, M., et al. Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system. Glia. , (2015).
  5. McClain, J., et al. Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
  6. Cunha Franceschi, R., et al. Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein. Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).
  7. Kabouridis, P. S., et al. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria. Neuron. 85 (2), 289-295 (2015).
  8. Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World Journal of Gastroenterology. 20 (32), 11273-11280 (2014).
  9. Clairembault, T., et al. Enteric GFAP expression and phosphorylation in Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 130 (6), 805-815 (2014).
  10. Sundaresan, S., et al. Gastrin Induces Nuclear Export and Proteasome Degradation of Menin in Enteric Glial Cells. Gastroenterology. 153, 1555-1567 (2017).
  11. Gulbransen, B. D. Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas? Gastroenterology. , (2017).
  12. Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  13. Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
  14. Bernstein, C. N., Vidrich, A. Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia. Glia. 12 (2), 108-116 (1994).
  15. Jaeger, C. B. Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats. Journal of Neural Transplantation & Plasticity. 5 (4), 223-232 (1995).
  16. Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. H. Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells. Gut. 56 (4), 489-496 (2007).
  17. Ruhl, A., Trotter, J., Stremmel, W. Isolation of enteric glia and establishment of transformed enteroglial cell lines from the myenteric plexus of adult rat. Neurogastroenterology & Motility. 13 (1), 95-106 (2001).
  18. Boyen, G. B., et al. Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation. BMC Gastroenterology. 11, 3(2011).
  19. Rosenbaum, C., et al. Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo. Public Library of Science One. 11 (3), e0151335(2016).
  20. Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
  21. Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system. Glia. 63 (2), 229-241 (2015).
  22. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  23. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  24. Kabouridis, P. S., et al. The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system. Gut Microbes. 6 (6), 398-403 (2015).
  25. Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia. The Journal of Comparative Neurology. 313 (4), 625-642 (1991).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

عزل غير إنزيميتحضين بـ EDTAمحلول استعادة الخلاياتعبير GFAPأوساط زراعة GDNFقياس التدفق الخلويالكيمياء النسيجية المناعية
عزل الخلايا الدبقية المعوي من سوبموكوسا والصفيحة بروبريا الماوس الكبار
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.