نقدم هنا، بروتوكولا للترجمة متعدد الألوان من البروتينات الغشاء واحدة في العضيات خلايا الحية. لإرفاق فلوروفوريس، تستخدم البروتينات الذاتية التوسيم. البروتينات، يقع في المقصورات الأغشية المختلفة من عضية نفسه، يمكن أن تكون مترجمة بدقة ~ 18 شمال البحر الأبيض المتوسط.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مجهرية التعريب متعدد الألوان البروتينات الغشاء واحدة في العضيات الحية خلايا الثدييات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
المعرفة بشأن إضفاء الطابع المحلي على البروتينات في سوبكومبارتمينتس الخلوية أمر حاسم لفهم وظيفتها المحددة. نقدم هنا، تقنية فائقة قرار الذي يسمح لتحديد ميكروكومبارتمينتس التي يمكن الوصول إليها للبروتينات بتوليد التعريب وتتبع الخرائط لهذه البروتينات. وعلاوة على ذلك، بالفحص المجهري التعريب متعدد الألوان، التعريب وتتبع ملامح بروتينات في سوبكومبارتمينتس مختلفة يتم الحصول عليها في وقت واحد. التقنية محددة للخلايا الحية ويقوم على تصوير متكررة من البروتينات الغشاء متنقلة واحدة. تنصهر فيها البروتينات التي تهم وراثيا مع علامات التوسيم ذاتية محددة، ما يسمى. هذه العلامات هي الإنزيمات التي تتفاعل مع الركازة بطريقة تساهمي. يضاف إلى هذه ركائز صبغات الفلورسنت. رد فعل البروتينات معلم الإنزيم مع الأسفار المسماة النتائج ركائز في البروتينات المسماة. هنا، تيتراميثيلرهوداميني (ترانسنيستريا) و "السليكون والرودامين" (السير) تستخدم الأصباغ الفلورية يعلق على ركائز للإنزيمات. باستخدام تركيزات الركيزة في الساعة إلى نطاق شمال البحر الأبيض المتوسط، ووسم المقايسة الفرعية يتحقق التي ينتج عنها إشارات مميزة. وقد تمت ترجمة هذه الإشارات مع ~ 15 – 27 دقيقة شمال البحر الأبيض المتوسط. التقنية تسمح للتصوير متعدد الألوان من جزيئات مفردة، حيث يقتصر عدد الألوان الأصباغ نفاذية الأغشية المتاحة ومرجع ذاتي وسم الإنزيمات. نحن إظهار جدوى هذه التقنية بتحديد التعريب إنزيم مراقبة الجودة (فتن)-التي يسببها كيناز 1 (PINK1) في الأقسام المختلفة المتقدرية أثناء معالجة به فيما يتعلق بغيرها من البروتينات الغشاء. اختبار التفاعلات الفيزيائية الحقيقية بين البروتينات واحد مسمى بشكل مختلف من جزيء واحد الحنق أو تتبع المشارك مقيد، رغم ذلك، نظراً لانخفاض درجات التوسيم إنقاص احتمال لوجود اثنين من البروتينات المجاورة المسمى في الوقت نفسه. بينما التقنية قوية للتصوير البروتينات في الغشاء المقصورات، في معظم الحالات من غير المناسب تحديد إضفاء الطابع المحلي على البروتينات القابلة للذوبان كثيري التنقل.
المقدمة
والهدف من هذا البروتوكول توفير طريقة تصوير لتوطين وتعقب غشاء واحد البروتينات داخل الخلايا الحية. ونحن ندعو هذا الأسلوب تتبع والتعريب مجهرية (تألم)1،2. مثل العشوائية بصري التعمير مجهرية (العاصفة)3 و4،Fluorescence فوتواكتيفيشن التعريب مجهرية ((و) النخيل)5، تألم وأسلوب تعريب fluorescence المستندة إلى جزيء واحد. ومع ذلك، أنها متميزة في الطريق أن تنقل بروتينات الغشاء في تركيبة مع التصوير المتكرر لنفس المسمى جزيء في المواقف المختلفة يكشف عن ميكروكومبارتمينت التي يمكن الوصول إليها للبروتين المتنقلة. وبعبارة أخرى، يتم تعيين تعريب ممكن م....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
البروتوكول التالي يتبع المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحوث مؤسسة محلية.
1-الأساليب
-
خلية ثقافة
- زراعة الخلايا، على سبيل المثال هيلا الخلايا (سرطان عنق الرحم البشرية)، في T25 قارورة ثقافة خلية التي تحتوي على 5 مل متوسط النمو في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
ملاحظة: للتصوير، وتقسيم الخلايا على استعداد كوفيرسليبس (راجع الخطوات 1.3 و 1.4) وتبقى في التصوير المتوسطة.
- زراعة الخلايا، على سبيل المثال هيلا الخلايا (سرطان عنق الرحم البشرية)، في T25 قارورة ثقافة خلية التي تحتوي على 5 مل متوسط النمو في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
-
تعداء الخلايا
ملاحظة: استخدام خطوط الخلايا ستابلي تعبر عن البروتينات المعلمة كلما أمكن24 لتجنب overexpression قوية. تعداء عابرة، التكيف مع مقدار بلازميد الحمض النووي يس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يمكن أن يساعد تحليل التصوير وكولوكاليزيشن متعدد الألوان تحديد الترجمة sub-أورجانيلار للبروتينات. أظهرنا ذلك في وقت سابق مع الفوسفاتيز سيتوسوليك وتنزين المناظرة، PINK1، يحتوي على مواقع فرعية المتقدرية مختلفة نظراً للتجهيز البروتياز المتقدرية17. PINK1 عاملاً هاما في ضمان الوظيفة المتقدرية34،35. لتحديد قد أنجز ترجمة PINK1 في المقصورات المتقدرية مختلفة أثناء المعالجة (الشكل 4A)، ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا، قدم تقنية للتعريب جزيء واحد لون مزدوج من البروتينات الغشاء المتنقلة. بعد البروتوكول، وبروتينات الغشاء تنصهر فيها لذاتي وسم البروتينات التي تتفاعل مع الأصبغة والرودامين جمهورية ترانسنيستريا المولدوفية وسيدي مترافق لركائز كل منها على. والرودامين الأصباغ هي مشرق وفوتوستابل، وتسمح بالتالي لتكرار التصوير1. للأداء الناجح، ولها عدة شروط ومواضيع حاسمة يجب أن يوضع في الاعتبار.
أولاً، من المهم اختيار المرشحات المناسبة وشق لفصل الإشارات من جمهورية ترانسنيستريا المولدوفية والس.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
المؤلف يود أن يشكر مجموعة الفيزياء الحيوية وبلير جاكوب في جامعة أوسنابروك للدعم المستمر وولاديسلاو كول للمساعدة التقنية، وإعداد المواد ومجلس سيلنانوس لتقديم مجاهر للاستخدام. وقد مولت المشروع SFB 944.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| (2- (4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازينيل) - حمض الإيثانسلفونيك ، 1 م) (HEPES) | بيوكروم | #1104E | |
| DC1: مقسم شعاع ثنائي اللون ؛ | Chroma | 640 dcxr | NC506031 |
| DC2: مرآة متعددة الأحرف ، شعاع مقسم | Chroma | zt405/488/561/640rpc | توقف |
| Dulbecco & حاد ؛ s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 1x (بدون Ca & amp; Mg) | Sigma-Aldrich & amp Co. | #RNBF8311 | |
| إيرل حاد. s MEM بدون فينول أحمر ، بدون L-Glutamine وبدون NaHCO3 يحتوي على 1٪ FBS ، 0.1٪ HEPES ، 0.1٪ NEAA ، 0.1٪ ألانيل-إل-جلوتامين و 34.78٪ كربونات هيدروجين الصوديوم (NaHCO3 0.75 جم / لتر) | التصوير | ||
| إيرل حاد ؛ s الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) مع الفينول الأحمر ، يحتوي على 1٪ مصل الأبقار الجنيني (FBS) ، 0.1٪ HEPES (2- (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl) -ethanesulfonic acid ، 1 M) ، و 0.1٪ أحماض أمينية غير أساسية (NEAA) | متوسط | ||
| النمو EF: مرشح انبعاث رباعي | النطاق AHF analyzentechnik | F72-866 | Brightline HC 446 نانومتر / 523 نانومتر / 600 نانومتر / 677 نانومتر |
| كاميرا EMCCD | Andor Andor | iXON 897 | EMCCD |
| مرشح الانبعاث مكعبات مرشح QuadView ، تحليل AHF | البرتقالي ، ممر | الترددي 582 - 619 نانومتر | |
| مرشح انبعاث QuadView مكعبات مرشح ، ممر نطاق أحمر | Chroma | 655 - 725 نانومتر (HQ 690/70) | |
| FBS (مصل الأبقار الجنينية) متفوقة | Biochrom | S0615 | |
| حبات الفلورسنت: TetraSpeck & trade ؛ المجهرية ، 0.1 & م ، فلورسنت أزرق / أخضر / برتقالي / أحمر غامق | Thermo Fisher Scientific | T7279 | الكريات المجهرية الفلورية |
| الجلوتامين | Biochrom | #0951C | |
| خلايا HeLa ؛ | DSMZ | ACC-57 | خلايا سرطان عنق الرحم من المريضة هنريتا تفتقر إلى |
| خلايا هيلا CI: :p aGFP ، مستقرة | Muster et al. ، PLOSOne 2010 | ||
| خلايا Hela CV g:: Halo7-Tag ، مستقرة | Appelhans et al. ، NanoLett 2012 | ||
| Hela cells Tom20 :: Halo7-Tag ، مستقرة | Appelhans et al. ، NanoLett 2012 | ||
| Image splitter | Photometrics | Dual-View QV2 | انبعاث الصور مقسم |
| التصوير: برنامج معالجة التصوير | ImageJ2 / فيجي | ||
| مجاني الغمر زيت - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518 ، ve = 45) | Carl Zeiss Jena GmbH | 444960-0000-000 | |
| مجهر epifluorescence المقلوب | أوليمبوس IX-71/73/83 | ||
| ليزر 561 نانومتر ، 200 ميجاوات | CrystaLaser | CL-561-200 | 561 نانومتر انبعاث |
| ليزر 642 نانومتر ، 140 ميجاوات | Omicron | Luxx-642-140 | انبعاث 642 نانومتر |
| MATLAB | MathWorks | R2013a | |
| MEM مع محلول الملح المتوازن من إيرل 2.2 جم / لتر NaHCO3 ، الجلوتامين المستقر بدون PR | Biochrom | FG-0385 | |
| MEM مع محلول الملح المتوازن من إيرل مع 2.2 جم / لتر NaHCO3 ، الجلوتامين المستقر ، Phenolred | Biochrom | FG-0325 | |
| MitoTracker & reg ؛ أحمر عميق FM | ثيرمو فيشر العلمي | M22426 | صبغ |
| MitoTracker & reg ؛ الأخضر FM | الحرارية فيشر العلمية | M7514 | صبغة |
| متعددة الأوضاع الاستقطاب البصري الحفاظ على الألياف أحادية | الوضع Pointsource / Qioptiq | KineFLEX | |
| NHS-PEG-MAL راب بوليمر ؛ | راب بوليمر GmbH Tü طلاء غطاء البنجين | ||
| الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) | Biochrom | #0802E | |
| PEG 800 (البولي إيثيلين جلايكول) 10٪ | Carl Roth GmbH | الفن رقم 0263.1 | طلاء الغطاء |
| Penicillin / Streptomycin | Biochrom | #0122E | |
| بلازميد لتعبير PINK1-Halo7-Tag | Beinlich et al. ، ACS Chemical Biology 2015 | ||
| بولي إل ليسين (1.2 مجم / مل) | سيجما ألدريتش وشركاه | قط. No.P9155 | طلاء غطاء |
| RGD الببتيد (AC-CGRGDS-COOH)نظام | الحفر Diagnostix GmbH, طلاء غطاء Gernsheim | / عزر مستقبلات Intergrin | |
| السيليكون Rhodamine مرتبط ب HaloTag & reg ;-Ligand (SiRHTL) | هدية شخصية من كاي جونسون | صبغ | |
| البرنامج المساعد تحليل البرمجيات | المكتوبة ذاتيا C. P. Richter, Biophysik Osnabrü ck | SLIMFAST 16g | |
| Tetramethylrhodamine / SNAP-Cell & reg ؛ TMR-Star مرتبط ب SNAP-Ligand (TMRstar) | نيو إنجلاند بيولوجي & ريج; | صبغة S9105S | |
| Tetramethylrhodamine مرتبطة ب HaloTag & reg ؛ -Ligand (TMRHTL) ؛ | Promega | G8251 | صبغة |
| مكثف TIRF | Olympus Cell | ^ TIRF MITICO System | TIRF مكثف TIRF مجهر |
| TIRF برنامج التحكم | Olympus cellSens 1.12 | ||
| TIRF | الهدف أوليمبوس | 150x هدف الزيت (NA 1.45; أوليمبوس UAPO) | |
| التربسين / EDTA 10x | Biochrom | # 0266 | |
| الماء H2O 99,5٪ روتيبوران & ريج ؛ منخفض العضوية | كارل روث GmbH | الفن. لا. HN57.1 |
المراجع
- Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy. Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).
- Appelhans, T., Busch, K.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
