优化的划痕实验方法 体外 使用自动化光学相机检测细胞迁移

摘要

在此，我们描述了一种检测细胞迁移的方法 体外 使用自动光学显微相机进行观察。划痕实验已被广泛应用于监测划痕闭合情况，通常在设定的时间段内进行跟踪。光学显微镜可实现对细胞迁移的可靠且低成本的检测。

摘要

细胞迁移是一个重要的过程，影响着伤口愈合和癌症等多种健康相关方面，因此开发研究细胞迁移的方法至关重要。划痕实验长期以来是最常用的方法 体外 一种用于检测具有抗迁移和促迁移特性的化合物的方法，因其成本低廉且操作简便而被广泛应用。然而，该实验常出现的问题是细胞在划痕边缘堆积。此外，为了获取实验数据，需要在一段时间内对同一位置进行多次成像，以比较细胞迁移的动态变化。尽管可使用不同的分析软件来描述划痕闭合情况，但这些方法耗时耗力、准确性较差，并会因反复操作导致温度变化循环。在本研究中，我们展示了一种优化的检测细胞迁移效应的方法， 例如 使用天然存在的蛋白质人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白及其N端肽乳铁素，作用于HaCaT表皮细胞系。关键的优化步骤是在PBS中进行洗涤和划痕处理，以消除上述细胞在边缘的积聚现象。这可能归因于阳离子的去除，已有研究显示阳离子会影响角质形成细胞的细胞间连接。为确保真实迁移的检测，本方案中加入了丝裂霉素C预处理步骤，该物质为DNA合成抑制剂。最后，我们展示了自动光学成像系统的应用，该系统可避免频繁的温度循环，减少人工操作在划痕闭合分析中的参与，同时提高实验重复性，并确保在不同时间点对划痕区域的相同部位进行持续分析。

引言

迁移是一个影响多种生理过程的重要现象。在伤口愈合过程中，细胞迁移有助于皮肤的再上皮化。而在难以愈合的伤口（如慢性伤口）中，机会性细菌会导致伤口感染，开放性伤口为细菌生长和生物膜的形成提供了理想环境^1,2。生物膜是耐药菌产生的重要原因之一，而耐药菌已成为现代社会面临的最大威胁之一³。在伤口愈合过程中，免疫细胞无法穿透生物膜。在癌症中，癌细胞的迁移是转移的关键步骤，而转移是实体瘤患者死亡的主要原因^4,5。因此，能够研究细胞迁移过程至关重要。

划痕实验常用于检测细胞迁移，因其成本低廉且易于在贴壁细胞系（如成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞系）上进行。^6,7如今，已有多种方法可用于进行划痕实验⁸，据报道已使用不同的材料，包括牙签⁹，细胞刮刀¹⁰，激光器¹¹和电流¹²

方案

该实验设计不存在伦理和法律限制，并已获得罗斯基勒大学的批准。实验装置的概览见图1，光学相机的工作机制见图2。

1. 准备

1. 所有操作均须在无菌超净工作台内进行，实验开始前使用70%乙醇清洁工作台面及所有设备。
2. 将光学相机置于37 °C、含5% CO₂的常规培养箱中，以确保细胞处于最佳培养条件。
3. 在T75培养瓶中，使用含10%胎牛血清（FBS）和1×抗生素（青霉素和链霉素）的DMEM培养基培养HaCaT细胞。
4. 每次传代时，使用1 mL 1×胰蛋白酶覆盖细胞层以消化脱离细胞，每3–4天传代一次。使用前需预先加热至室温。

2. 在48孔微孔板中生成HaCaT细胞单层

1. 用巴斯德吸管从T75培养瓶中移除培养基。
2. 向T75培养瓶中加入5 mL 1×无菌PBS，洗涤贴壁细胞。
   注意：确保PBS中不含钙和镁。
3. 轻轻晃动培养瓶使PBS充分接触细胞，然后用巴斯德吸管吸除PBS。
4. 重复步骤2.2–2.3。
5. 向培养瓶中加入1 mL 1×胰蛋白酶，并均匀覆盖细胞层....

结果

HaCaT 是一种角质形成细胞系，是皮肤中最丰富的细胞类型之一。当皮肤发生伤口时，皮肤细胞开始增殖并迁移至伤口床，以闭合伤口（图3）。因此，这两个过程对于正常的伤口愈合至关重要。

光学相机可实时追踪这两个过程。对于细胞迁移，系统提供三组数据：细胞覆盖面积、间隙宽度和间隙面积。在监测经乳铁蛋白、乳铁素肽或表皮生长因子（EGF）处理的划痕时，光学显微镜使我们能够随时间追踪这三个参数。经过48小时孵育后，我们观察到EGF处理组伤口闭合率达到95%，而未处理对照组仅为38%（图3A）。不同形式的乳铁蛋白和乳铁素肽的伤口闭合率介于33%至62%之间，其中肽段的效果强于其母体蛋白。根据初始划痕后间隙宽度的变化所计算出的伤口闭合百分比也可绘制成图（图3B）。

讨论

迁移在发育、伤口愈合、免疫学和癌症研究中的重要性促使人们发展出多种研究迁移的方法。迁移可以表现为细胞扩展或闭合间隙的行为。通常检测划痕闭合，因为与以特定形态培养细胞相比，先以单层培养细胞再制造划痕更为简便⁸。本研究展示了一种优化的手动划痕方法，该技术易于掌握且成本低廉。我们引入了DNA合成抑制剂丝裂霉素C，增加了一次洗涤步骤以优化划痕效果，相较于已发表的方法有所改进¹⁸，并采用了光学相机以实现高通量研究。

的 体外 划痕实验需要使用能够良好贴壁并附着于孔板底部的贴壁细胞系，同时需抑制细胞增殖以检测细胞在划痕区域的迁移能力。这两个特征对实验至关重要。为准确检测细胞迁移，已有多种方法被报道，包括降低血清浓度或在划痕前对细胞进行饥饿处理。¹⁴，DMSO，或各种抑制剂 ^13,27通常可以使用无血清培养基，但某些细胞.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
oCelloScope	BioSense Solution ApS		光学相机
UniExplorer 软件	BioSense Solution ApS		(8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT 细胞			由 Bispebjerg 医院捐赠
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	HaCaT 细胞培养基
FBS	Gibco	10270	胎牛血清
PBS	Gibco	D837	不含 Mg+ 和 Ca2+
青霉素-链霉素	Sigma	P0781	抗生素
胰蛋白酶 (10x)	Sigma	T3924
丝裂霉素 C	Tocris	3258	抑制增殖
微量滴定板	Greiner Bio-one	677 180
培养箱	Panasonic		37°C, 5% CO2
血细胞计数板	Assistent		Türk (0.1 mm)
移液器辅助器	Accu-Jet pro