Простой и воспроизводимый метод подготовить образцы мембраны из микрососудов мозга свежевыделенных крыса

Hrvoje Brzica; Wazir Abdullahi; Bianca G. Reilly; Patrick T. Ronaldson

doi:10.3791/57698

Method Article

Простой и воспроизводимый метод подготовить образцы мембраны из микрососудов мозга свежевыделенных крыса

DOI:

10.3791/57698

⸱

May 7th, 2018

Hrvoje Brzica*¹ , Wazir Abdullahi*¹ , Bianca G. Reilly¹ , Patrick T. Ronaldson¹

¹Department of Pharmacology, College of Medicine, University of Arizona, Tucson

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь описан метод для изоляции микрососудов мозга крыс и для подготовки проб мембраны. Этот протокол имеет явное преимущество производства обогащенного microvessel образцы с приемлемым белка выход из отдельных животных. Образцы могут затем использоваться для анализа надежных белка на мозг микрососудистой эндотелия.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является динамической барьер ткани, которая реагирует на различные раздражители, патофизиологические и фармакологические. Такие изменения, вытекающие из этих стимулов может значительно модулировать доставки лекарств в мозг и выдвижением, вызывают значительные трудности в лечении центральной нервной системы (ЦНС) заболеваний. Многие BBB изменения, которые влияют на фармакотерапии, включать белки, которые локализованы и выражены на уровне эндотелиальных клеток. Действительно такие знания о физиологии BBB в здоровье и болезни вызвал значительный интерес к изучению этих мембранных белков. С точки зрения исследований фундаментальной науки это подразумевает потребность в простой, но надежный и воспроизводимый метод для изоляции микрососудов из ткани мозга, добываемых из подопытных животных. Чтобы подготовить образцы мембраны из свежевыделенных микрососудов, важно, что препаратов примере быть обогащенный в эндотелиальных клетках, но ограничены в присутствии других типов клеток, нервно-сосудистого подразделения (т.е., астроциты, микроглии, нейронов, pericytes). Дополнительным преимуществом является возможность готовить образцы из отдельных животных с целью захвата истинной изменчивость белков в экспериментальной населения. В этой рукописи предоставляются подробности относительно метода, который используется для изоляции микрососудов мозга крыс и подготовки образцов мембраны. Microvessel обогащения, от образцов, полученных, достигается с помощью четырех шагов центрифугирования, где декстрана включен в буфере выборки. Этот протокол может быть легко адаптирована в других лабораториях для их собственных конкретных приложений. Было показано, что образцы, созданные из этого протокола дают надежные экспериментальные данные от белка анализа экспериментов, которые могут значительно облегчить понимание BBB ответы на физиологические, патофизиологические и фармакологические стимулы.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) существует на стыке центральной нервной системы (ЦНС) и кровообращения и играет важную роль в поддержании гомеостаза головного мозга. В частности BBB функций для точного управления вещества концентрации в внеклеточной жидкости мозга и чтобы эффективно поставки этих питательных веществ, которые необходимы ткани мозга выполнять значительные метаболические требования ЦНС¹. Эти роли подразумевают, что BBB, который существует в первую очередь на уровне микрососудистой эндотелиальных клеток, должны обладать дискретных механизмов, которые позволяют некоторые вещества, чтобы получить доступ к паренхимы мозга, обеспечив....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все изложенные ниже процедуры были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) и соответствовать национальных институтов здравоохранения (НИЗ) и животных исследования: In Vivo экспериментов (прибытие) руководящих принципов представления докладов. Процедурные поток для протокола изображен на рисунке 1.

1. Установка для процедуры

Подготовка мозга microvessel буфера (BMB). Начните с весом 54,66 g D-маннит, 1,90 g EGTA и базы 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (то есть, Tris) 1,46 g в чистый стакан. Добавление 1.0 Л деионизированной воды. Смешайте компоненты в ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментальный поток для изоляции микрососудов мозга крыс и для подготовки проб мембраны microvessel показан на рисунке 1. С помощью процедуры, представленные здесь, свидетельствует успешное изоляции нетронутыми микрососудов от мозга крысы (рис. 2A). Эти суда были получены после завершения центрифугирования с декстрана и сразу же до начала ultracentrifugation подготовить образцы мембраны (т.е. После завершения шага 4.10). На э.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье описан простой и эффективный метод подготовки образцы протеина мембраны из микрососудов, свежезаваренным изолированы от ткани мозга крысы. Несколько подходов для изоляции микрососудов мозга крыс и/или поколение мембранных препаратов от изолированных microvasculature поступили в литературе¹³^,²⁰^,^,²¹²² ^, ²⁴. Хотя в принципе аналогично Протокол изоля.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантов от национальных институтов здравоохранения (R01-NS084941) и биомедицинских исследований Комиссии Аризона (ADHS16-162406) PTR. WA получил прошлом поддержки от предварительного докторских назначение национальных институтов здравоохранения обучения Грант (T32-HL007249).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Коктейль ингибиторов протеазы	Sigma-Aldrich	#P8340	Компонент буфера микрососудов головного мозга
D-маннитол	Sigma-Aldrich	#M4125	Компонент буфера микрососудов головного мозга
EGTA	Sigma-Aldrich	#E3889	Компонент буфера микрососудов головного мозга
Trizma Base	Sigma-Aldrich	#T1503	Компонент буфера микрососудов головного мозга
Декстран (MW 75,000)	Spectrum Chemical Mftg Corp	#DE125	Декстран, используемый на этапах центрифугирования для отделения микрососудов от паренхимы мозга
Zetamine	MWI Animal Health	#501072	Общий анестетик
Ксилазин	Western Medical Supply	#5530	Общий анестетик
0,9% физиологический раствор	Western Medical Supply	Н/Д	Общий анестетик разбавляющая
фильтровальная бумага (диаметр 12,5 см)	VWR	#28320-100	Используется для удаления мозговых оболочек из мозговой ткани
Центрифужные пробирки	Sarstedt	#60.540.386	Одноразовые пробирки используются для этапов центрифугирования декстрана
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay	ThermoFisher Scientific	#23236	Измерение концентрации белка в мембранных препаратах
Wheaton Overhead Power Homogenizer	DWK Life Sciences	#903475	Требуется для гомогенизации образцов
10,0мл стеклянной ступки и измельчителя тканей	пестика DWK Life Sciences	#358039	Требуется для гомогенизации образцов
Соляная кислота	Sigma-Aldrich	#H1758	Требуется для регулировки pH буферов
Бычья сыворотка Альбумин	ThermoFisher Scientific	#23210	Стандарт белка для Брэдфордского анализа
Стандартные щипцы	Fine Science Tools	#91100-12	Используется для препарирования мозговой ткани
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	#16020-14	Используется для вскрытия черепа с целью изоляции мозга
Конические центрифужные пробирки 50 мл	ThermoFisher Scientific	#352070	Используются для сбора мозговой ткани после изоляции
Стекло Пастер Пипец	ThermoFisher Scientific	#13-678-20C	Используются для аспирации клеточного мусора после декстрановых вращений
Этанол, безводный	Sigma-Aldrich	#459836	Используются для очистки тканей шлифовальной машины; разбавляются до 70% дистиллированной водой
Ультрацентрифужные пробирки	Beckman-Coulter	#41121703	Используются для ультрацентрифугирования образцов

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Простой и воспроизводимый метод подготовить образцы мембраны из микрососудов мозга свежевыделенных крыса

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles