녹색 형광 단백질 박테리아에서 감염 하는 동안 전달 하는 이펙터를 시각화 하기 위해 시스템을 분하시오

요약

형광 단백질 기반 접근 호스트 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터를 모니터링 하는 도전입니다. 형광 단백질 및 유형 III 분 비 시스템 간의 비 호환성 때문입니다. 여기, 최적화 된 분할 superfolder GFP 시스템 호스트 식물 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터의 시각화 사용 됩니다.

초록

박테리아, 다양 한 식물 질병의 원인이 되는 가장 중요 한 에이전트 중 하나는 호스트 식물 세포 식물 면역 체계를 파괴에 effector 단백질의 집합을 분 비. 감염 시 세포질 이펙터 유형 III 분 비 시스템 (T3SS)를 통해 호스트 cytosol에 전달 됩니다. 식물 세포에 배달, 후에 effector(s) 생존 및 병원 체의 복제에 대 한 호스트 세포 프로세스를 변조 하는 것 특정 compartment(s) 대상. 비록 pathogenicity에 형광 단백질을 사용 하 여 그들의 기능을 이해 하는 호스트 셀에 effector 단백질의 subcellular 지역화의 박테리아에서 직접 주입 하는 이펙터의 역학 조사에서 일부 연구 하고있다 T3SS와 형광 단백질 간의 비 호환성으로 인해 도전 하고있다.

여기, 우리가 호스트 셀에서 세균 T3SS 통해 전달 하는 이펙터의 지역화를 시각화 하기 위해 최적화 된 분할 superfolder 녹색 형광 단백질 시스템 (sfGFP^OPT)의 최근 우리의 방법을 설명 합니다. sfGFP11 (11^번째 β 물가의 sfGFP)-태그 이펙터는 T3SS을 통해 분 비 사이트에서 형광 방출에 표적으로 하는 특정 세포 기관이 sfGFP1-10^선택 (1-10^번째 β 물가의 sfGFP) 행간 조립 될 수 있다. 이 프로토콜 애기 Nicotiana benthamiana 식물에 특정 세포 기관이에 슈 도모 나 스 syringae 에서 effector 단백질으로 재구성된 sfGFP 형광 신호를 시각화 하는 절차를 제공 합니다.

서론

식물은 수많은 침입 병원 체 포함 박테리아, 곰 팡이, 바이러스, 곤충 및 nematodes 그들의 수명 주기 동안 발생 하는 착 유기 체. Phytopathogens, 중 녹 종 등 Ralstonia 종, 그램 음성 세균성 병원 체 상처 또는 stomata 및 hydathode 같은 자연 구멍을 통해 입력 하 여 그들의 호스트 식물을 감염¹. 성공적으로 호스트 식물 식민지로 세균성 병원 균 독성 요인²의 다양 한 개발을 진화 했다. 박테리아는 기 주 식물을 침공, 그들은 일련의 독성 단백질 주사-이펙터로 알려진-그들의 pathogenicity 홍보를 식물 세포에 직접. 이 이펙터 억제 또는 공장 타고 난 면역을 조절 하 고 세균 생존³결과 호스트 세포 프로세스를 조작.

병원 성 박테리아는 주로 호스트 셀⁴에 직접 효과 기 단백질을 제공 하는 T3SS를 사용 합니다. T3SS는 호스트 셀⁵의 사출 사이트 내부와 외부 세균 막 비 계 단백질 구조에서 연결 바늘 같은 채널 분자 주사기를 유사 합니다. 이....

프로토콜

참고: 모든 단계는 수행 실 온에서 달리 명시 하지 않는 한.

1. 식물 재료 (4 주)의 준비

1. 명. benthamiana 식물에 대 한 준비
   1. 명. benthamiana 의 각 냄비의 토양 표면에 2 씨앗을 뿌리 다, 플라스틱 돔 트레이 커버 및 25 ° C, 16/8-h 명암 photoperiod 사이클 60% 습도 성장 챔버에에서 발 아를 씨를 허용.
   2. 2 주 후, 선택 하 고 각 냄비에 작은 경종을 폐기 단계 1.1.1에서에서 발 아에 대 한 적용 동일한 성장 조건 하에서 식물 성장을 계속. 매 2 일 트레이 당 물 1 리터를 추가 합니다.
      참고: 식물의 성장 조건 실험실에서 달라질 수 있습니다. 따라서, 건강 한 상태에 있는 식물을 성장 하는 일반 급수 프로토콜을 따릅니다.
   3. 일주일에 새로운 용지함에 식물을 전송 하 고 추가 성장 위한 충분 한 공간이 그들을 주선. 계속 그들은 나이의 4 주에 침투 될 준비가 될 때까지 단계 1.1.1에서에서 설명한 조건 하에서 식물 성장.
      참고: 식물 성장 연구소에서 성장 상태에 따라 달라질 수 있습니다. 일반적으로, 우리는 그 4 주 된 찾을 명. benthamiana 식물....

결과

GFP의 β 배럴 구조 11 β 물가의 구성 이며, 두 조각, 1-10^번째 가닥 (GFP1-10^선택)와 11^일 (GFP11) 가닥으로 나눌 수 있습니다. 비록 둘 다 2 개의 파편 스스로 형광의 자기 조립된 sfGFP 근접 (그림 1A)에 존재 하는 2 개의 파편 때 형광을 내보낼 수 있습니다. 이 시스템에서는, sfGFP1-10^선택-식물 녹 sfGFP11 태그 이펙터를 들고와 주사는 애기 명. benthamiana 를 표현. 호스트 셀의 cytosol로 모나 스 에 의해 전달 sfGFP11 태그 이펙터는 cytosol에서 표현 sfGFP1 10^OPT 를 재구성 하 고 대상 구획 (그림 1B)에 함께 이동.......

토론

여기에 설명 된 프로토콜 모니터링 호스트 식물 세포 감염 시 세균 T3SS에 의해 주입 하는 effector 단백질의 정확한 지역화에 사용 됩니다. 이전, 분할 GFP 시스템 포유류 단백질^23,36의 subcellular 지 방화, 살 모 넬 라 T3E 지역화, Agrobacterium VirE2 납품에 T4SS 통해 공부 하는 도구로 사용 되었다는 식물 세포³⁷. 식물 세포에서이 시스템을 적용, 이전 연구 유전자 변형 옥수수 식물을 constitutively 세포질 GFP1-10과 유전자 변형 균, 표현 Ustilago maydis, GFP11 태그 effector 단백질을 표현 하는 사용. 그러나, 옥수수-미국 maydis 시스템 되지 않았습니다 성공적인 translocated effector 단백질 식 수준의 약한.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Arabidopsis 형질전환 계통			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. 분할 형광 단백질 단편을 사용한 유형 III 분비를 통한 Pseudomonas syringae 효과기의 시공간 모니터링. 식물 세포. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	ABRC	CS69831
NU-sfGFP1-10	ABRC	CS69832
PT-sfGFP1-10	ABRC	CS69833
MT-sfGFP1-10	ABRC	CS69834
PX-sfGFP1-10	ABRC	CS69835
ER-sfGFP1-10	ABRC	CS69836
GO-sfGFP1-10	ABRC	CS69837
PM-sfGFP1-10	ABRC	CS69838
Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. 분할 형광 단백질 단편을 사용한 유형 III 분비를 통한 Pseudomonas syringae 효과기의 시공간 모니터링. 식물 세포. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	Addgene	97387
NU-sfGFP1-10	Addgene	97388
PT-sfGFP1-10	Addgene	97389
MT-sfGFP1-10	Addgene	97390
PX-sfGFP1-10	Addgene	97391
GO-sfGFP1-10	Addgene	97393
PM-sfGFP1-10	Addgene	97394
ER-sfCherry1-10	Addgene	97403
ER-sfYFP1-10	Addgene	97404
CYTO-sfCFP1-10	Addgene	97405
sfGFP11 태그가 지정된 T3SS 기반 이펙터 전달 시스템용 Gateway 호환 벡터	Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. 분할 형광 단백질 단편을 사용한 유형 III 분비를 통한 Pseudomonas syringae 효과기의 시공간 모니터링. 식물 세포. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2	Addgene	98250	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; 카나마이신에 대한 내성 (25 ug / ml)
pBK-GW-1-4	Addgene	98251	pAvrRpm1 : GW : HA-2xsfGFP11 : AvrRpm1t; Kanamycin (25 ug/ml)에 저항하는
pBK-GW-2-2	Addgene	98252	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; 카나마이신에 대한 내성 (25 ug / ml)
pBK-GW-2-4	Addgene	98253	pAvrRpm1 : AvrRPM1sp : GW : HA-2xsfGFP11 : AvrRpm1t; 카나마이신에 대한 내성 (25 ug / ml)
pBG-GW-1-2	Addgene	98254	pAvrRpm1 : GW : HA-sfGFP11 : AvrRpm1t; 겐타마이신에 대한 내성 (25 ug / ml)
pBG-GW-1-4	Addgene	98255	pAvrRpm1 : GW : HA-2xsfGFP11 : AvrRpm1t; 겐타마이신에 대한 내성 (25 ug / ml)
pBG-GW-2-2	Addgene	98256	pAvrRpm1 : AvrRPM1sp : GW : HA-sfGFP11 : AvrRpm1t; 겐타마이신에 대한 내성 (25 ug / ml)
pBG-GW-2-4	Addgene	98257	pAvrRpm1 : AvrRPM1sp : GW : HA-2xsfGFP11 : AvrRpm1t; Gentamycin (25 ug/ml)
Bacterial strains
Agrobacterium tumefaciens GV3101			Csaba Koncz 및 Jeff Schell에 대한 내성, TL-DNA gene 5의 promoter는 새로운 유형의 Agrobacterium binary vector에 의해 운반되는 chimaeric 유전자의 조직 특이적 발현을 제어합니다. 몰 젠 유전자. 204,383-396 (1986); 겐타마이신(50 ug/ml) 및 리팜피신(50 ug/ml)에 대한 내성
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500			Kvitko, B. H. et al. Pseudomonas syringae pv. 토마토 DC3000 유형 III 분비 효과기 유전자의 레퍼토리에서 결실은 효과기 간의 기능적 중복을 나타냅니다. PLoS 병원. 5 (4) (2009).; 리팜피신에 대한 내성 (100 ug / ml)
< 강> 매체 구성 요소 < / 강력 >
< > 식물 발아 배지 < / 강력 >			2.165g / L Murashige & 추가 Skoog 분말, 물에 10 g/L 자당. pH 5.8로 조정하고 2.2g/L 피타젤을 추가합니다. 자동 가속.
무라시게 & 비타민을 포함한 Skoog 배지	Duchefa Biochemie	M0222	4 >C에 보관하십시오.
설탕	Duchefa Biochemie	S0809
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
LB media			10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모 추출물, 10 g/L NaCl을 물에 첨가합니다. 고체 매체의 경우 15g/L 마이크로 한천을 추가합니다. 오토클레이브.  용액을 55°C로 식히십시오. C를 선택하고 필요한 경우 항생제를 추가합니다.
트립톤	BD Bioscience	211705
효모 추출물	BD Bioscience	212750
NaCl	Duchefa Biochemie	S0520
Micro 한천	Duchefa Biochemie	M1002
King's B media			10 g/L 프로테아제 펩톤 #2, 1.5 g/L 무수 K2HPO4, 15 g/L의 한천을 물에 넣습니다. 오토 클레이 브. 55도로 식히십시오. C를 선택하고 멸균 15ml/L 글리세롤, 5ml/L MgSO4를 배지에 첨가합니다. 필요한 경우 항생제를 추가하십시오.
프로테오스 펩톤	BD Bioscience	212120
무수 K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128 USP
Glycerol	Duchefa Biochemie	G1345
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Bacto Agar	BD Bioscience	214010
<강>만니톨-글루타메이트(MG) 액체 배지			니톨 10g/L, L-글루탐산 2g/L, KH2PO4 0.2g/L, NaCl 0.2g/L<><>를 물에 첨가합니다. pH 7
Mannitol	Duchefa Biochemie	M0803
L-글루탐산	Duchefa Biochemie	G0707
KH2PO4	Sigma-Aldrich	NIST200B
침투 완충액			10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µ M 아세토시링곤. 산도 5.6; 사용하기 전에 새 버퍼를 준비하십시오.
MES	Duchefa Biochemie	M1503	물에 100mM(pH 5.6) 스톡을 준비합니다. 필터는 살균합니다.
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	물에 100mM 스톡을 준비합니다. 오토 클레이 브.
아세토시링곤	시그마-알드리치(Acetosyringone Sigma-Aldrich	) D134406	DMSO에서 150mM 스톡을 준비합니다.
컨포칼 현미경 장비/재료
710 레이저 스캐닝 컨포칼 시스템	Carl Zeiss
Axio observer Z1 도립 현미경	Carl Zeiss
Propidium iodide	ThermoFisher	P1304MP

ER-sfGFP1-10 Addgene 97392 만