Hydrogels מהונדסים חלבון רקומביננטי הן ממינוי תרבית תאים 3D הם מאפשרים tunability מלאה של עמוד השדרה פולימר ולכן, microenvironment את התא. כאן, אנו מתארים התהליך של היטהרות חלבון רקומביננטי כמו אלסטין ויישומו בחיי הידרוג 3D תא אנקפסולציה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הייצור של חלבון כמו אלסטין Hydrogels כימוס, Immunostaining של תאים ב- 3D
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
טכניקות מימדי תרביות רקמה (2D) היה חיוני להבנת ביולוגיה של התא הבסיסי. עם זאת, היעדר מערכות התרבות המסורתית של רקמות 2D מטריצה תלת מימדי (3D), וכתוצאה מכך משמעותי נתק בין תוצאות נאסף במבחנה ו vivo בתוך. כדי לטפל מגבלה זו, החוקרים היה לתכנן פלטפורמות תרביות רקמה הידרוג תלת-ממד שיכולים לחקות את המאפיינים הביוכימי ו ביופיזיקלי של microenvironment תא ויוו . מחקר זה הניעה את הצורך לפתח פלטפורמות גשמי התומכים תא 3D כימוס של מבחני הביוכימי במורד הזרם. חלבון רקומביננטי הנדסה מציעה ערכת כלים ייחודיים הידרוג תלת-ממד גשמי עיצוב ופיתוח על-ידי מתן שליטה מסוימת של חלבון רצף ולכן, לפי סיומת, פוטנציאל מכני וביוכימי מאפייני תוצאות מטריקס. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור הביטוי נגזר recombinantly אלסטין, כמו חלבון (ELP), אשר יכול לשמש כדי hydrogels טופס עם תכונות מכניות באופן עצמאי tunable וריכוז ליגנד תא-דבק. בהמשך אנו מציגים מתודולוגיה תא אנקפסולציה בתוך אמרסון, לייק ופאלמר hydrogels ומוטבעים מכתים immunofluorescent עוקבות של תאים עבור ניתוח במורד הזרם כמת.
מבוא
במהלך המאה האחרונה, מימדי תרביות רקמה (2D) התפתחה כלים אינטגרלי ללמוד תא יסוד ביולוגיה במבחנה. בנוסף, הפרוטוקולים יחסית נמוכים ופשוטים לקבלת תרבית תאים 2D הובילו האימוץ שלה על פני תחומים רבים ביולוגי ורפואי. עם זאת, מחקרים שנעשו בעבר הראו כי פלטפורמות 2D מסורתי עשוי להוביל לתוצאות כי לסטות בצורה ניכרת האלה שנאספו ויוו, גורם זמן יקר ומימון מבוזבז עבור מחקר קליני מונחה1,2, 3. אנחנו ואחרים משערים כי אי-התאמה זו לייחס חוסר רמזים הביוכימי, biophysical יליד מסופקים על התאים תרבותי על משטחים 2D, אשר יכול להיות הכרחי עבור הפצת אופטימלית, ההבשלה של סוגי תאים שונים.<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. לשכנו ביטוי בפרוטוקול
- יום 1: גידול המושבה starter
- להכין פלטות אגר אמפיצילין, כלורמפניקול מאת autoclaving 25 גר' לוריא ציר 15 גרם של אגר לכל 1 ליטר של מים הנדסה גנטית. ברגע הפתרון הוא מקורר עד ~ 60 ° C, להוסיף 1 מ"ל של מניות אמפיצילין (100 מ"ג/מ"ל מים הנדסה גנטית) ו- 1 מ"ל כלורמפניקול מניות (34 מ"ג/מ"ל אתנול 70%) 1 ליטר של אגר לפתרון הסופי ריכוזי µg 100/mL µg 34/mL , בהתאמה. 20 מ של הפתרון הסופי להעביר צלחות פטרי 10 ס מ עם פיפטה סרולוגית ולאפשר את אגר לגבש. לעטוף את צלחות פטרי עם מצלמות-מיקרוסקופים וחנות ב 4 º C.
הערה: צלחות פטרי שניתן לאחסן ב 4 ° C עד שבועיים. - פסים מדגם קטן של BL21 (DE3) pLysS e. coli מן מ....
- להכין פלטות אגר אמפיצילין, כלורמפניקול מאת autoclaving 25 גר' לוריא ציר 15 גרם של אגר לכל 1 ליטר של מים הנדסה גנטית. ברגע הפתרון הוא מקורר עד ~ 60 ° C, להוסיף 1 מ"ל של מניות אמפיצילין (100 מ"ג/מ"ל מים הנדסה גנטית) ו- 1 מ"ל כלורמפניקול מניות (34 מ"ג/מ"ל אתנול 70%) 1 ליטר של אגר לפתרון הסופי ריכוזי µg 100/mL µg 34/mL , בהתאמה. 20 מ של הפתרון הסופי להעביר צלחות פטרי 10 ס מ עם פיפטה סרולוגית ולאפשר את אגר לגבש. לעטוף את צלחות פטרי עם מצלמות-מיקרוסקופים וחנות ב 4 º C.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ELPs בשימוש פרוטוקול זה המורכב מעובדים חמישה אזורים: תג T7 His6 תג, אתר פצילות enterokinase (EK), אזור ביו-אקטיביות, אזור כמו אלסטין (איור 1). T7 ותגי His6 מאפשרים זיהוי קל באמצעות טכניקות תספיג סטנדרטי. מבוא של אתר המחשוף EK מאפשר הסרת אנזימטי של האזור תג, במידת הצורך. האזור ביו-אקטיבי מקודד עבור המורחבת, נגזר fibronectin תא דבק ('RGDS') או רצפים ('RDGS') ללא דבק. לבסוף, חזור המרכזי של האזור, כמו אלסטין מכיל קבוצת ליזין באתר שאריות חוות המאפשרת crosslinking .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ביטוי חלבון רקומביננטי טיהור הוא כלי רב עוצמה כדי לסנתז biomaterials עם הפארמצבטית גבוהה. בעיקר בשל כניסתו של שיבוט מולקולרי ממוסחר, פלסמידים רקומביננטי מותאם אישית ניתן לרכוש מהספקים מספר, אשר מפחית באופן משמעותי את הזמן כדי לעבוד עם חומרים כמו ELPs. באופן דומה, ניתן לבקש פלסמידים ישירות מן המעבדה שמקורם כאשר העבודה המקורית נתמכה על ידי חוזה הפדרלי, העבודה העתידית תהיה לשימוש ללא כוונת רווח. הרצף המלא של חומצת אמינו לשכנו שפורסם בעבר עבור לשכנו מספר גרסאות31. עם זאת, הביטוי לתהליך טיהור בסופו של .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים תודה פאלמר, ה באבו (סטנפורד נוירוכירורגיה) למתן מאתר באמנות NPCs. וקטור באיור 4 בשימוש ומותאמים מאמנות רפואי שרת תחת יצירתי של מלאי ייחוס 3.0 רישיון (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). חלק מעבודה זו בוצעה ב סטנפורד ננו משותפים מתקנים (SNSF), הנתמכים על ידי הקרן הלאומית למדע תחת פרס מרכזים לגיל הרך-1542152. N.A.S. מאשר תמיכה מן הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים (32GM 008412). ובין מאשר תמיכה של NRSA NIH מראש דוקטורט (F31 EB020502), חוקרים לגשת לתוכנית של Siebel. S.C.H. מאשר תמיכה של מכוני הבריאות הלאומיים (U19 AI116484 ו- R21 EB018407), הקרן הלאומית למדע (DMR 1508006), מכון קליפורניה עב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <ביטוי וטיהור חלבון >דמוי אלסטין | |||
| 10 ס"מ צלחות פטרי | תרמו פישר סיינטיפיק | FB0875713 | |
| 70% אתנול | RICCA כימי | 2546.70-1 | |
| אמוניום סולפט | סיגמא-אולדריץ' | A3920-500G | |
| אמפיצילין | תרמו פישר סיינטיפיק | BP1760-25G | |
| בקטו אגר | תרמו פישר סיינטיפיק | 9002-18-0 | |
| BL21(DE3)pLysS תאים מוכשרים | Invitrogen | C606003 | |
| כלורמפניקול | אמרסקו | 0230-100G | |
| דאוקסיריבונוקלאז I מלבלב בקר | סיגמא-אולדריץ' | DN25 | |
| EDTA מלח דיסודיום, דיהידראט | תרמו פישר סיינטיפיק | O2793-500 | |
| גליצרול | תרמו פישר סיינטיפיק | BP229-4 | |
| איזופרופנול | תרמו פישר סיינטיפיק | A451-4 | |
| איזופרופיל ובטא;-D-1-תיוגלקטופירנוסיד (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | BP1755-10G | |
| Luria Broth | EMD Millipore | 1.10285.5007 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals | 195381 | |
| נתרן כלורי | Thermo Fisher Scientific | BP358-212 | |
| נתרן הידרוקסיד | סיגמא-אולדריץ' | S 8045-1KG | |
| (0.22 μ m) | Millipore | SLGP033RB | |
| Terrific Broth | Millipore | 71754-4 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Cell Encapsulation בהידרוג'לים ELP תלת מימדיים | |||
| 0.22 μ מסנני מזרק m | Millipore | SLGV004SL | |
| יריעת סיליקון בעובי 0.5 מ"מ | Electron Microscopy Science | 70338-05 | |
| צלחות תרבית רקמות 24 בארות | קורנינג | 353047 | |
| ביופסיה חד פעמית פונץ' (2 מ"מ) | אינטגרה מילטקס | 33-31 | |
| פונץ' ביופסיה חד פעמית (4 מ"מ) | אינטגרה מילטקס | 33-34 | |
| פונץ' ביופסיה חד פעמית (5 מ"מ) | אינטגרה מילטקס | 33-35 | |
| דולבקו' s פוספט חוצץ מלח (DPBS) | קורנינג | 21-031-CM | |
| מס' 1 12 מ"מ כיסויי זכוכית | תרמו פישר סיינטיפיק | 12-545-80 | |
| טטראקיס(הידרוקסימתיל)פוספוניום כלוריד (THPC) | סיגמא-אולדריץ' | 404861-100 מ"ל | |
| 0.5% טריספין/EDTA | תרמו פישר | 15400054 | |
| <חזק>אימונוציטוכימיה של תאים בהידרוג'לים ELP תלת מימדיים | |||
| 16% (w/v) פרפורמלדהיד (PFA) | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 15701 | |
| אלבומין בסרום בקר (BSA) | Roche | 3116956001 | |
| DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד) | בדיקות מולקולריות | D1306 | |
| בסרום חמור | מעבדות ביולוגיות | 7332100 | |
| נוגדן משני נגד עכבר עיזים (AF488) | בדיקות מולקולריות | A-11017 | |
| נוגדן משני נגד ארנב עיזים (AF546) | בדיקות מולקולריות | A-11071 | |
| סרום עיזים | Gibco | 16210-072 | |
| נוגדן ראשוני של עכבר נסטין | BD Pharmingen | 556309 | |
| עכבר Sox2 טכנולוגיית | איתות תאי | 23064S | |
| לק | אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית | 72180 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Vectashield קשיח הרכבה בינונית | וקטור לאבס | H-1400 |
מקורות
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-d....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
