Célula única quantificação de mRNA e expressão de proteínas de superfície em CD4 infectados por vírus de imunodeficiência simiana+ T células isoladas de macacos Rhesus

Andrey Tokarev; Matthew Creegan; Michael A. Eller; Mario Roederer; Diane L. Bolton

doi:10.3791/57776

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Artigo de método

Célula única quantificação de mRNA e expressão de proteínas de superfície em CD4 infectados por vírus de imunodeficiência simiana⁺ T células isoladas de macacos Rhesus

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DOI:

10.3791/57776

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25 de setembro de 2018

Andrey Tokarev¹ , Matthew Creegan¹ , Michael A. Eller¹ , Mario Roederer² , Diane L. Bolton¹

¹US Military HIV Research Program, Henry M. Jackson Foundation, Walter Reed Army Institute of Research, ²Vaccine Research Center, NIAID, NIH

Neste artigo

Resumo

Descrito é uma metodologia para quantificar a expressão dos 96 genes e 18 proteínas de superfície por células únicas ex vivo, permitindo a identificação de diferencialmente expressaram genes e proteínas em células infectadas por vírus em relação as células não infectadas. Aplicamos a abordagem de estudo CD4 infectadas SIV⁺ T células isoladas de macacos rhesus.

Resumo

Análise de célula única é uma ferramenta importante para dissecar heterogêneas populações de células. A identificação e isolamento de células raras podem ser difícil. Para superar este desafio, combinando uma metodologia indexados citometria de fluxo e elevado-throughput multiplexado quantitativa cadeia da polimerase (qPCR) foi desenvolvido. O objetivo foi identificar e caracterizar o vírus da imunodeficiência símia (SIV)-infectados células presentes dentro macaques do rhesus. Através da quantificação da proteína classificando fluorescência-ativado da pilha (FACS) e mRNA por qPCR, células infectadas por vírus são identificadas pela expressão do gene viral, que é combinada com medidas de gene e proteína de anfitrião para criar um perfil multidimensional . Chamamos a abordagem, avaliação de célula única Proteo-transcriptional alvo ou tSCEPTRE. Para executar o método, células viáveis estão manchadas com anticorpos fluorescentes específicas para marcadores de superfície utilizados para isolamento de FACS de um subconjunto de células e/ou análise fenotípica a jusante. Células individuais são classificadas seguido de Lise imediata, multiplex transcrição reversa (RT), pré-amplificação por PCR e qPCR alto throughput de até 96 transcrições. Medições de FACS são registradas no momento da triagem e posteriormente relacionadas com os dados de expressão do gene por posição bem para criar uma proteína combinada e perfil transcricional. Para estudar infectados com SIV diretamente células ex vivo, as células foram identificadas por qPCR detecção de múltiplas espécies de RNA virais. A combinação de transcrição viral e a quantidade de cada fornecem uma estrutura para classificar as células em estágios diferentes do ciclo de vida viral (por exemplo, produtivo versus não-produtivos). Além disso, tSCEPTRE de células SIV⁺ foram em relação ao não infectados células isoladas do mesmo espécime para avaliar genes diferencialmente expressos anfitrião e proteínas. A análise revelou anteriormente apreciada heterogeneidade de expressão do RNA viral entre células infectadas, assim como na vivo mediada por SIV pós-transcricional gene regulamento com resolução de célula única. O método tSCEPTRE é relevante para a análise de qualquer população de célula passível de identificação pela expressão da proteína de superfície marker(s), host ou patógeno genes ou suas combinações.

Introdução

Muitos patógenos intracelulares contam com máquinas de célula de acolhimento para replicar, muitas vezes alterando a biologia de pilha de anfitrião ou direcionamento especifico subpopulações de células hospedeiras para maximizar suas chances de propagação. Como resultado, processos biológicos células comumente são rompidos, com consequências deletérias para a saúde geral do hospedeiro. Compreender as interações entre os vírus e as células hospedeiras, na qual eles replicar irá elucidar mecanismos de doença que podem auxiliar no desenvolvimento de terapias melhoradas e estratégias para prevenir a infecção. Diretas ferramentas analíticas que permitem o estudo das intera....