המאמר מתאר פרוטוקול ממוטב עבור ביצוע פרוסות קיימא רקמת המוח, יותרת המוח, תוך שימוש medaka של דג teleost (Oryzias latipes), ואחריו אלקטרופיזיולוגיות הקלטות של יותרת המוח תאים בטכניקה תיקון-קלאמפ עם תצורת תיקון מחורר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פרוסות המוח, יותרת המוח בריא לחקירות אלקטרופיזיולוגיות של תאים יותרת המוח בדגים Teleost
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
חקירות אלקטרופיזיולוגיות של תאים יותרת המוח נערכו זנים חוליות רבים, אבל מעט מאוד דגים teleost. בין אלה, רוב ברור בוצעו על חלופה מועדפת תאים הראשי. כדי לשפר את ההבנה שלנו של מה teleost תאים יותרת המוח, להתנהג בסביבה יותר ביולוגית רלוונטית, פרוטוקול זה מראה כיצד להכין פרוסות המוח, יותרת המוח קיימא באמצעות medaka של דגים מים מתוקים קטנים (Oryzias latipes). עושה את פרוסות המוח, יותרת המוח, pH ו osmolality של כל הפתרונות הותאמו הערכים שנמצאו נוזלי גופו של דגי תיה 25-28 מעלות צלזיוס. בעקבות הכנה פרוסה, הפרוטוקול מדגים כיצד לערוך הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בטכניקה תיקון שלם-תא מחורר-קלאמפ.... טכניקת תיקון-קלאמפ היא כלי רב עוצמה חסרת תקדים רזולוציה טמפורלית ורגישות, המאפשר חקירת תכונות חשמליות מתאי כל שלם אל תעלות יונים יחיד. תיקון מחורר הוא ייחודי בכך. זה שומר על הסביבה תאיים ללא פגע מונע גורמים רגולטוריים ציטוזול להיות מדולל לפי הפתרון אלקטרודה פיפטה תיקון. לעומת זאת, בעת ביצוע הקלטות שלם-תא המסורתי, זה היה ציין כי תאים יותרת המוח medaka במהירות מאבדות את יכולתן לפטר את פוטנציאל פעולה. בין ניקוב טכניקות שונות זמינים, פרוטוקול זה מדגים כיצד להשיג ניקוב של קרום תוקנו באמצעות ונעביר b. שהוא גוסס
מבוא
בלוטת יותרת המוח הוא איבר האנדוקרינית המפתח גולגולת ממוקם מתחת להיפותלמוס, אחורי הצנטר. הוא מייצר, מפריש הורמונים שישה עד שמונה סוגים תאים מסוים. הורמוני יותרת המוח מהווים ביניים בין המוח לבין איברים היקפיים ולנסוע מגוון רחב של תהליכים פיזיולוגיים חיוניים כולל גדילה, רבייה של ההסדרה של הומאוסטזיס. בדומה נוירונים, תאי האנדוקרינית של ההיפופיזה נמצאים חשמלית להתרגש עם היכולת לירות פוטנציאל פעולה באופן ספונטני 1. תפקידם של אלה פוטנציאל פעולה הוא תא התלויים. מספר סוגי תאים של יונקים ההיפופיזה, פוטנציאל פעולה יכול לרומם את תאיים Ca2 + מספיק לשחרור מתמשכת של הורמון 2. בנוסף, בלוטת יותרת המוח מקבל מידע מופחתים והן מעכ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
לטיפול בבעלי חיים כל בוצעה על-פי המלצות טיפול ולרווחתם של בעלי חיים מחקר ב אוניברסיטת הנורבגית למדעי החיים, ותחת פיקוחו של חוקרים מורשים.
1. הכנת כלים ופתרונות
הערה: כל הפתרונות צריכים להיות סטרילי. תשומת לב תינתן ועד ה-pH של osmolality (osmol/kg מים) של כל הפתרונות, אשר צריך להיות בזהירות מותאם הסביבה חוץ-תאי המין למד. pH ו osmolality צריך להיות מותאם עם ציוד אלקטרוני מדויק, כגון ph ו- osmometer נקודת הקיפאון בהתאמה.
- להפוך 500 מ"ל של פתרון במיוחד הסלולר ללא Ca2 + (Ca2 + חינם EC): 150 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 1.3 מ'מ MgCl2, גלוקוז 4 מ מ, 10 מ מ Hepes.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול זה מדגים פרוטוקול צעד אחר צעד כיצד להשיג הקלטות אלקטרופיזיולוגיות אמין מתאי יותרת המוח (gonadotrope), באמצעות קו הטרנסגניים medaka [Tg (lhb- hrGfpII)] היכן היעד תאים (מייצרי Lh gonadotropes) מסומנות עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP).
בתחילה, החקירות אלקטרופיזיולוגיות נערכו באמצעות התצורה תאים שלמים. עם זאת, פוטנציאל פעולה ספונטנית לא נצפו בכל התאים למד. בקבוצת משנה של תאים, פוטנציאל פעולה יכול להיות מופעלות באמצע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בטכניקה תיקון-קלאמפ על פרוסות המוח, יותרת המוח דורש אופטימיזציה זהירה. פרוטוקולים היטב אופטימיזציה עבור ביצוע חקירות לחיות תאים במיוחד teleosts מוגבלות, עם הרוב של פרסומים באמצעות פרוטוקולים המבוססים על מערכות יונקים. בהקשר זה, חשוב להיות מודעים לעובדה כי מספר פרמטרים פיזיולוגיים כמו pH osmolality הם לא רק מינים תלויים, אבל גם תלוי מאוד אם המדובר האורגניזם חי ביבשה או במים. דגים, יש גם צורך, לקחת בחשבון, אם הם חיים בסביבה ימית או מים מתוקים. לדוגמה, הלחץ חלקי2 CO הוא נמוך בהרבה בדגים ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף
תודות
אנו מודים גב' LourdesCarreon G טאן עזרה שמירה על המתקן medaka, אנתוני Peltier עבור נתוני המחשה. עבודה זו מומן על-ידי NMBU ועל -ידי מועצת המחקר של נורבגיה, המספרים גרנט 244461 (חקלאות ימית תוכנית) ו 248828 (תכנית החיים הדיגיטליים נורבגיה).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| דבק כירורגי | WPI | VETBOND | 3M דבק רקמות |
| להבי נירוסטה | Campden Instruments | 752-1-SS | |
| תבניות מתכת | SAKURA | 4122 | |
| נבל פלדה | וורנר מכשירים | 64-1417 | |
| PBS | SIGMA | D8537 | |
| Ultrapure LMP agarose | invitrogen | 166520-100 | |
| פיפטות תיקון | מכשיר סאטר | BF150-110-10HP | בורוסיליקט עם נימה OD: 1.5 מ"מ, תעודת זהות: 1.10 מ"מ |
| מיקרוסקופ פרוסות | Scientifica | pro6000 | |
| P-Clamp10 | מכשירים מולקולריים | #1-2500-0180 | sofware |
| Digitizer Digidata 1550A1 | מכשירים מולקולריים | DD1550 | |
| מגבר Multiclap 700B Headstage CV-7B | התקנים מולקולריים | 1-CV-7B | |
| GnRH | Bachem | 4108604 | H-GLU-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH מלח טריפלואורואצטט |
| מושך פיפטה | Sutter Instrument | P-1000 | |
| אמפוטריצין B | SIGMA | A9528 | אנטיביוטיקה יוצרת נקבוביות |
| פוליאתילנימין | SIGMA | P3143 | 50% PEI תמיסת |
| מיקרופילר מזרק | WPI | MF28/g67-5 | |
| זכוכית לגשר האגר | מכשיר סאטר | BF200-116-15 | בורוסיליקט עם נימה OD: 2.0 מ"מ, תעודת זהות: 1.16 מ"מ אש מלוטשת |
| מיקרו-מנהל | מיקרוסקופיה קוד פתוח | ||
| optiMOS sCMOS מצלמה | Qimaging | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | |
| סוניקטור | Elma | D-7700 Sinen | |
| NaCl | SiGMA | S3014 | |
| KCl | SiGMA | P9541 | |
| MgCl2 | SiGMA | M8266 | |
| D-גלוקוז | SiGMA | G5400 | |
| Hepes | SiGMA | H4034 | |
| CaCl< תת>2 | SiGMA | C8106 | |
| סוכרוז | SiGMA | 84097 | |
| D-מניטול | SiGMA | 63565 | |
| חומצה MES | SIGMA | M0895 | |
| BSA | SIGMA | A2153 |
מקורות
- Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. Ion channels and signaling in the pituitary gland. Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).
- Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling. Trend....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
