Summary
이 프로토콜의 목표 성인 산호 샘플 파라핀에 포함 되 고 유리 슬라이드에 구분에 교 잡 현장에서 수행 하는 것입니다. 이것은 파라핀 끼워 넣어진 조직에서 RNA 방지 감지 프로브의 공간 표현을 시각화 하는 데 사용 하는 질적 방법입니다.
Abstract
산호는 바다의 전반적인 건강 뿐만 아니라 인간의 건강에 대 한 중요 한 중요 한 바다 무척 추 동물. 그러나, 상승 바다 온도 해양 산성화 등 인간의 영향으로 인해 산호는 점점 더 위협을 받고. 이러한 과제를 해결 하기 위해 세포 및 분자 생물학 산호의 건강 진단에 대 한 중요 한 것을 입증 했다. 인간의 의학에서 일반적으로 사용 되는 기법 중 일부를 수정 연구자의 능력을 치료 하 고 산호 저장에 크게 향상 시킬 수 있습니다. 이 해결 하기 위해 현장에서 교 잡 인간의 의학 및 진화 개발 생물학에서 주로 사용 하는 프로토콜 스트레스 성인 산호에 사용 하기 위해 적응 되었습니다.
이 방법의 목적은 파라핀에 포함 되 고 유리 슬라이드에 구분 된 성인 산호 조직에서 RNA 프로브의 공간 표현을 시각화 하는 것입니다. 이 메서드는 파라핀 및 샘플의 재 수 화 작용의 제거, 샘플, 사전 교 잡 부 화, RNA 프로브의 교 잡 그리고 RNA 프로브의 시각화의 침투성을 보장 하기 위해 샘플의 전처리에 중점을 둡니다. 이 때 강력한 방법 비 모형 유기 체를 사용 하 여 특정 유전자가 표현 및 프로토콜은 다른 비 모형 유기 체에 쉽게 적용할 수 있습니다. 그러나, 방법은 식 강도 시각화 단계 및 프로브 농도 동안 사용 시간에 따라 달라질 수 있기 때문에 그것은 주로 질적 제한 됩니다. 또한,이 프로토콜 최대 5 일 (와 많은 경우에, 더 이상) 사용 되는 프로브에 따라 걸릴 수 있습니다 인내심 필요 하다. 마지막으로, 일반적인 배경 얼룩은 일반적, 그러나이 한계를 극복할 수 있습니다.
Introduction
산호는 중요 한 생태계 빌더 바다와 인간의 건강1,,23에서 생물 다양성에 대 한 중요 한. 그들은 기후 변화 및 다른 anthropogenic 스트레스 위협을 받고 있다 그리고 많은 산호 종 비판적으로 멸종 위기에 놓인 것으로 간주 됩니다. 따라서, 세포 및 분자 도구 진단 스트레스 산호를 위한 중요 한 필요가 있다. 또한, 거기 약간 이해 된다 성인 산호 조직, 그리고이 유전자의 기능에 따라서 작은 이해 내 유전자가 표현 하는 곳에 대 한. 이 문제를 해결 하려면 우리는 현장에서 교 잡 (틱), 일반적으로 사용 되는 프로토콜 인간의 의학 및 진화 개발 생물학, 성인 산호의 파라핀 끼워 넣어진 조직 추출에서 사용 하기 위해 적응 시켰다. 이 기술은 열 스트레스에 노출 등 스트레스 이벤트 받은 성인 산호에 사용 될 때 가장 강력 하다. 그러나,이 기술은 다양 한 조직 및 산호의 삶의 단계에 사용할 수 있습니다 그리고만 열 스트레스 산호4,,67에 국한 되지 않습니다. 또한,이 기술은 사용할 수 cDNA 순서 정보는 조직 또는 모든 metazoan의 셀에 사용할 수 있습니다.
이 방법의 목적은 보존 및 파라핀에 포함 되었으며 슬라이드에 구분 성인 산호 조직 내의 RNA 프로브를 시각화 하는 것입니다. 이 방법은 성인 산호 조직 내에서 핵 산의 시각화에 대 한 허용 하는 강력한 진단 도구입니다. 처음에이 방법은 의료 진단에 대 한 개발 하 고 이후 발생 생물학 및 진화 개발 생물학8,,910분야에서 인기 있는 도구가 되고있다. 분의 비-모델 시스템, 게놈에서 특히 중요 한 방법 이기도 하 고 transcriptomic 시퀀스 데이터 사용할 수 있지만 공간 유전자 표현 패턴을 알 수 있습니다. 진단 작업 비 모델 시스템에 대 한이 기술은 강력 하다는 세포와 조직 관심사의 유전자를 표현 하 고 더 많은 타겟된 치료 접근8,,910, 이어질 수 있습니다 나타낼 수 있습니다 때문에 11,12. 마지막으로,이 기술은 질적 및 양적 유전자 표현 데이터11와 결합 하는 때 더 강력한입니다.
이 문서에서 설명 하는 방법은 이미 digoxigenin (발굴) 설계 연구원에 게 관심이 될 것입니다-표시 된 RNA 프로브 (감각 및 antisense 프로브)는 이제 제자리에서 교 잡의 샘플을 프로브를 실행할 준비가 되었습니다. 이 메서드를 수행 하기 위해 파라핀 산호 직물의 2 개의 직렬 섹션 테스트 중인 각 프로브에 대 한 필요 합니다. 한 섹션 감지 프로브 및 센스 프로브에 대 한 다른 사용 됩니다. 감각 프로브를 나타내는 일반적인 바인딩 컨트롤 될 것입니다. 만약 얼룩이 지는 감각 프로브에서 관찰, 센스 프로브 관심의 RNA를 특정 하지 않습니다. 프로브는 모든 유전자 표현에 대 한 디자인할 수 있습니다. 이 프로토콜에 몇 가지 예는 사용 이전 산호에 열 스트레스 동안 표현할 것을 발견 했다: FBJ murine 다리 바이러스 oncogene 체 B (포-B), 활성 단백질 (AP1), 종양 괴 사 인자 수용 체 41 (TNFR 41)11. 그들의 처리는 많은 안전10때문에 방사성 프로브를 사용 하 여 분 발굴 표시 된 RNA 프로브를 사용 하 여 것이 좋습니다. 또한,이 기술은 매우 민감한 이며 다양 한 조직 및 열 스트레스 성인 산호13,14,,1516넘어 배아에서 수행할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1입니다. 파라핀 제거
주의: 증기 두건에서 다음 단계를 수행 합니다.
- 100% 크 실 렌 유리 Coplin 단지 10 분의 후드 아래에 있는 얇은 sectioned 파라핀 끼워 넣어진 슬라이드 dewax 크 실 렌 녹는 플라스틱으로 플라스틱 Coplin jar를 사용 하지 마십시오. 사용 하기 전에 압력솥에 Coplin 항아리를 소독.
- 다음 4 개의 메 마른 유리 Coplin 항아리를 준비: 100% 에탄올, 80% 에탄올, 70% 에탄올과 60% 에탄올. RNase 무료 물과 에탄올을 희석.
- 100% 에탄올과 메 마른 유리 Coplin jar를 슬라이드를 전송 하 고 10 분 동안 그들을 담가. 10 분 후 빈 유리 Coplin jar 고 새로운 100% 에탄올을 바꿉니다. 다시 10 분에 대 한 슬라이드를 담근 다.
- 1 분 동안 80% 에탄올과 메 마른 유리 Coplin jar를 슬라이드를 전송 합니다.
- 1 분에 70% 에탄올과 메 마른 유리 Coplin jar를 슬라이드를 전송 합니다.
- 1 분 60% 에탄올과 메 마른 유리 Coplin jar를 슬라이드를 전송 합니다.
2. RNA 프로브 교 잡의 준비에 대 한 슬라이드 전처리
- 달리 지정 하지 않는 한, 실내 온도에 다음 세척을 수행 합니다. 느린 속도로 궤도 통에 실 온 세척을 수행 합니다. 최대 5 개의 슬라이드 공간 살 균 슬라이드 우편물을 사용 하 여 슬라이드의 세척에 대 한.
- 슬라이드를 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1의 18 mL와 멸 균 슬라이드 우편물 전송. 실 온에서 5 분 동안 세척.
- 1 x PBS에서 부 어와 즉시 조직의 프로브 침투 수 있도록 가수분해 K와 함께 슬라이드에는 조직 치료. 슬라이드 우편물을 가수분해 K 솔루션의 약 18 mL을 추가 (작업 솔루션 농도 표 1 참조). 15 분 동안 37 ° C에서 품 어. 동요 하지 마십시오.
- 슬라이드는 잠복기 동안 prehybridization 버퍼 (Prehybe 버퍼)를 준비 합니다. Prehybe 버퍼 10 분 동안 끓는 물 욕조에 배치 다음 5 분 동안 얼음 목욕에 냉각. Prehybe 버퍼의 제조 법, 표 1을 참조 하십시오.
- 가수분해 K 솔루션 털어 여 성분 K 반응의 소화를 중지 하 고 즉시 슬라이드 우편물을 0.2% 글리신-PBS 솔루션의 18 mL를 추가. 슬라이드 우편물 실 온에서 5 분 동안 앉아 보자.
- 0.2% 글리신-PBS 솔루션에 밖으로 부 어과 각 슬라이드 우편물을 2 배 염 분 나트륨 시트르산 (SSC) 솔루션의 18 mL을 추가. 슬라이드 2에서 씻어 100-150 rpm에서 떨고와 실 온에서 10 분 동안 x SSC.
3. RNA 프로브 교 잡에 대 한 준비에 슬라이드 prehybridization
- 슬라이드 2로 세척 되는 동안 x SSC, 새로운 살 균 슬라이드 우편물을 얻기와 슬라이드 우편물에 Prehybe 버퍼의 약 18 mL를 넣어. 교 잡 온도에서 교 잡 오븐으로 슬라이드 우편물을 놓습니다.
참고: 교 잡 온도 50-60 ° c.에서 일반적으로 범위에만 사용 되는 프로브에 따라 달라 집니다. - 2 x SSC 세척 완료 되 면, SSC, 및 장소 2에 밖으로 부 어 1 시간에 대 한 교 잡 오븐에서 Prehybe 버퍼에 슬라이드 메일러 내의 슬라이드.
4입니다. 교 잡의 RNA 프로브
- 슬라이드는 교 잡 오븐에서 Prehybe 버퍼와 잠복기는, 하는 동안 교 잡 프로브 솔루션을 준비 합니다.
- 교 잡 버퍼 (µ 프로브 0.5 L 교 잡 버퍼의 24.5 µ L)에서 각 프로브를 희석.
참고: 교 잡 버퍼에 대 한 제조 법은 표 1에서 발견 된다. 트레일러-놀 즈 외 에 조사 준비 및 농도의 예를 찾을 수 있습니다. 11. - 12 분, 86-90 ° C 열 블록에 희석된 프로브를 배치 후 얼음에 1 분 동안 쿨.
- 교 잡 버퍼 (µ 프로브 0.5 L 교 잡 버퍼의 24.5 µ L)에서 각 프로브를 희석.
- 슬라이드 우편물 교 잡 오븐에서 제거 하 고 멸 균 핀셋을 사용 하 여 슬라이드 우편물에서 슬라이드를 개별적으로 제거. 종이 타월에 평평 슬라이드를 신중 하 게 조직 샘플 주위 Prehybe 버퍼 초과 닦아. 샘플, 터치 하지 않도록 주의 하 고 조직 샘플의 건조를 방지 하기 위해 신속 하 게 작업.
- PAP 펜 조직을 둘러싸십시오. 25 µ L를 피펫으로 희석된 프로브 솔루션의 적용 하 고 플라스틱 coverslip로 샘플을 커버.
- SSC + 챔버 바닥에 있는 50 %formamide 솔루션 x 4 슬라이드 습기 챔버에 샘플을 놓습니다.
- 모든 슬라이드에 프로브를 추가한 일단 교 잡 교 잡 온도 50-60 ° c에서 24 시간 이상 오븐에 슬라이드 습기 챔버를 배치 보육 시간 탐사선의 농도 따라 다를 수 있습니다 하지만 24 시간 최소 이어야 한다.
- 희석 프로브 야간 보육, 후 교 잡 오븐에서 슬라이드 습기 챔버를 제거 합니다.
- 각 조직 치환 하지 않도록 주의 되 고 슬라이드에서 coverslips를 제거 합니다. 1000 µ L 피 펫에 2 x SSC 솔루션의 1000 µ L을 추가 하 고 부드럽게 슬라이드를 씻어.
- 실 온에서 5 분 동안 2 x SSC 솔루션의 18 mL와 멸 균 슬라이드 우편물에 슬라이드를 놓습니다. 솔루션을 부 어 하 고 신선한 2의 18 mL x SSC. 부드러운 진동으로 실 온에서 5 분 동안 다시는 부 화를 반복 합니다.
- 2 x SSC 솔루션을 붓는 다. 실 온에서 1 x SSC 솔루션 및 5 분 동안 세척의 18 mL를 추가 합니다. 1 x SSC 솔루션을 부 어 하 고 신선한 1의 18 mL x SSC. 부드러운 진동으로 실 온에서 5 분 동안은 부 화를 반복 합니다.
- 1 개 부 어 x SSC. 동요 하지 않고 42 ° C에서 0.5 x SSC와 10 분 동안 세척 18 mL를 추가 합니다. SSC 및 바꾸기 x 0.5에 밖으로 부 어 신선한 0.5 18 mL와 함께 그것은 x SSC. 동요 하지 않고 42 ° C에서 10 분 동안 다시 세척.
5입니다. RNA 프로브의 시각화
참고: 프로브를 시각화, BM 보라색 사용 됩니다 개발 과정. 그러나,이 단계 전에 여러 세척은 얼룩에 대 한 샘플을 준비 해야 합니다.
- 1 분에 대 한 MgCl2 MgCl2, 없이 AP 버퍼에 밖으로 부 어 1 x Boehringer 임 차단 버퍼 maleic 산 버퍼 희석의 18 mL를 추가 하지 않고 알칼리 성 인산 가수분해 효소 버퍼 (AP-버퍼)의 18 mL와 함께 슬라이드를 씻어. 부드러운 진동으로 슬라이드 우편물에서 실내 온도에 적어도 1 시간에 품 어.
참고: Boehringer 임 차단 버퍼와 maleic 산 버퍼 사용 들어찬 되었고 발굴 세척 및 블록 버퍼 설정에서 구입한 (사용 가능한 상업적으로).- 또는, 4 ° C에서 하룻밤 인큐베이션을 수행할 수 있습니다. 더 이상 차단 기간 아닌 특정 바인딩의 모양을 줄일 것입니다.
- 20 mL 희석된 발굴 안티-digoxigenin-AP 놀라 우 파편의 준비 (안티 발굴 항 체 = 안티 발굴 항 체 + 20 mL 1 Boehringer 임 차단 버퍼 x 2 µ L). 이 1 플라스틱 슬라이드 우편물에 사용 하기 위해 충분 하다. 이 솔루션의 경우 하나 이상의 슬라이드 메일러 사용 되는 준비 되어야 한다.
- 새로운 살 균 슬라이드 우편물을 방지 발굴 항 체를 추가 하 고 슬라이드 슬라이드 우편물 안티 발굴 항 체 솔루션에 전송. 부드러운 떨고와 3 시간 실 온에서 품 어.
- 부 화, 후 부 항 발굴 항 체 어 고 부드러운 떨고와 5 분 동안 MgCl2 없이 AP 버퍼의 18 mL와 슬라이드 우편물에 슬라이드를 씻어.
- MgCl2, 없이 AP 버퍼에 밖으로 부 어과 AP 버퍼의 18 mL을 추가. 부드러운 진동으로 5 분 동안 세척. 5 분 부 화 후 AP 버퍼에서 부 어, 신선한 AP-버퍼, 18 mL와 함께 그것을 대체 하 고 부드러운 떨고와 5 분 동안 세척.
- 어둠 속에서, AP-버퍼에 밖으로 부 어 하 고 슬라이드 우편물에 보라색 BM의 18 mL를 추가 합니다. 어둠 속에서 실 온에서 슬라이드를 품 어, 개발 되 고 조사에 따라 시각화를 위한 모든 ½ h. 반응 시간이 달라 집니다 보라색 컬러 개발에 대 한 검사.
참고: BM 보라색 시각화, 대신 개발 솔루션 만들 수 있습니다 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP)를 사용 하 여 니트로 블루 tetrazolium (NBT). 자세한 내용은 표 1 을 참조 하십시오. - 어둠 속에서 실 온에서 5 분에 대 한 트리 스-EDTA (테) 버퍼의 18 mL와 함께 새로운 살 균 슬라이드 우편물에 슬라이드를 전송 하 여 컬러 개발을 중지 합니다.
- TE 버퍼에서 부 어와 슬라이드 우편물을 어둠 속에서 1 분 동안 세척 RNase 무료 물 18 mL을 추가.
- 슬라이드, 물에서 제거 하 고 조직의 가장자리 주위에 그들을 건조. 매체를 장착 하는 글리세롤을 추가 하 고 장소는 coverslips. 사진 촬영 준비가 될 때까지 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 프로토콜을 완료 한 후 관심의 RNA 프로브를 표현 하는 조직과 세포의 식별 달성 될 것 이다. 이 프로토콜에 대 한 대표적인 결과 AP 1, FosB, 및 TNFR41입니다. 이러한 결과 이전 트레일러 놀 즈 외 에 출판 11, 열 스트레스에 노출 된 성인 산호에 프로브는 RNA의 표시 공간 표현 합니다. 다른 얼룩 유형의 두 가지 예는 그림 1에 표시 됩니다. 그림 1A 확산 조직 얼룩의 예입니다. 얼룩 뿐만 아니라 특정 셀에에서는 조직에 걸쳐 발견 된다. 여기, 반대로 감각 AP-1의 식 표 피와 구두 gastrodermis11 (그림 1A)에 걸쳐 발견 된다. 얼룩이 확산 하 고 하나의 특정 세포 유형에 하지 차별 이다. 얼룩이 지기의이 유형에 대 한 그것은 동시에 감각 제어를 위해서 특히 중요 한 결과의 일부 일반적인 얼룩이 지기 때문일 수도 있습니다.
얼룩의 두 번째 유형은 있는 얼룩만 있으면 특정 셀에 셀 전용입니다. FosB (그림 1B) 및 TNFR41 (그림 1C) 얼룩의이 유형을 표시. 모두 이러한 프로브11열 스트레스 노출 되었던 성인 산호의 조직 샘플에 사용 되었다. 반대로 감각 패널에 보라색 얼룩이 관찰 된다. TNFR41은 cnidocytes만 cnidarians (그림 1) 내에서 발견 되는 세포 유형의 가족의 종류에 표현 했다. 특히, 그것은 스테인드 microbasic mastigophore 세포 기관이 (nematocysts)를 생성 하는 nematocytes 및 spirocysts, 산호 직물의 표 피 내에서 모두 발견된을 생산 하는 spirocytes. Nematocytes는 calicodermis; 같은 산호의 다른 조직 층에 또한 있다 그러나,이 특정 샘플에 수행 된 단면, 때문에 그 정보가 수집 하지 수 없습니다. FosB는 또한 스테인드 cnidocytes 하 고 spirocytes 및 nematocytes 관련 되었다. 모두 이러한 프로브, 감각 제어 얼룩, 얼룩 방지 감지 프로브에 대 한 실제로 특정가 나타내는 보였다. 이러한 다른 유형의 프로브와 함께 있을 수 있는 착 색 기술의 대표적인 결과 (확산 조직 얼룩 및 셀 전용 얼룩)의 두 종류가 있습니다. 이 다양성, 컨트롤을 사용 하는 감각 일반적인 얼룩을 결정 하는 중요 한 되어 있습니다.
그림 1: 특정 셀을 묻은 그의 대표적인 결과. (A) 첫 번째 패널에서에서 AP-1 프로브에 대 한 감각 제어는 작은 얼룩이 있으면 슬라이드 내에서 보여줍니다. 두 번째 패널에서 AP-1에 대 한 방지 감지 프로브가 보여줍니다이 프로브 얼룩 조직에 걸쳐 확산. 얼룩은 구두 gastrodermis와 표 피에 적용 됩니다. 얼룩이 지기의이 유형으로 실행 되도록 관찰 얼룩 특정 감각 제어 중요 하다. (B) 첫 번째 패널에서 FosB 프로브에 대 한 감각 컨트롤 작은 얼룩 존재 보여줍니다. 두 번째 패널에서 FosB에 대 한 방지 감지 프로브가 보여줍니다 얼룩 spirocytes 및 nematocytes, 표 피와 구두 gastrodermis에 걸쳐 확산 얼룩과 관련. (C)에서 첫 번째 패널, TNFR 41 프로브에 대 한 감각 제어 작은 얼룩이 지는 슬라이드에 표시 됩니다. 두 번째 패널에서 TNFR 41 안티 감지 프로브 spirocytes, nematocytes, 및 microblastic mastigophores 얼룩 특정 보여줍니다. 약어: spirocytes (SP), symbiodium (SY), nematocyte (북동), microbasic mastigophores (MM), symbiont 포함 된 gastrodermal 셀 (수). 이 수치는 권한을11재현 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 참고: 압력가 마로 소독 유리 그릇에 살 균, RNase 무료 물으로 모든 희석 할 수 있습니다. | |||
| Prehybe 버퍼 (50 mL) | 추가 | ||
| Formamide | 25 mL | ||
| 20 X SSC (pH 4.5) | 12.5 mL | ||
| 20 mg/mL 헤 파 린 | 0.1 mL | ||
| 50 X Denhardts | 5 mL | ||
| 20% 트윈-20 | 0.5 mL | ||
| 20% SDS | 0.5 mL | ||
| 10 mg/mL 연어 정자 DNA (추가 하기 전에 변성) | 2 mL | ||
| RNase 무료 물 | 4.4 mL | ||
| 참고: 솔루션 disposible 50 mL 튜브에 만들 수 있습니다. 연어 정자 열 블록에 솔루션을 추가 하기 전에 5 분 동안 끓는 변성 한다. | |||
| 교 잡 버퍼 (47 mL) | 추가 | ||
| Formamide | 25 mL | ||
| 20 X SSC (pH 4.5) | 12.5 mL | ||
| 20 mg/mL 헤 파 린 | 0.1 mL | ||
| 50 X Denhardts | 5 mL | ||
| 20% 트윈-20 | 0.5 mL | ||
| 20% SDS | 0.5 mL | ||
| 10 mg/mL 연어 정자 DNA (추가 하기 전에 변성) | 2 mL | ||
| RNase 무료 물 | 1 mL | ||
| 참고: 솔루션 disposible 50 mL 튜브에 만들 수 있습니다. 연어 정자 열 블록에 솔루션을 추가 하기 전에 5 분 동안 끓는 변성 한다. | |||
| 10 X PBS (1.0 L) | 추가 | ||
| 18.6 m m NaH2포4 | 2.56 g | ||
| 84.1 mM 나2HPO4 | 11.94 g | ||
| 1750 mM NaCl | 102.2 g | ||
| 노트: 1.0 L 볼륨에 대 한 물 약 800 mL에 인산 염을 혼합. PH를 확인 하십시오. 7.4 ± 0.4 이어야 한다입니다. 그렇지 않으면 pH 7.4 NaOH의 HCl. 추가 NaCl와 물의 나머지 부분을 조정 합니다. 후 pH 조정된 압력솥 이다. | |||
| 20 X SSC (1.0 L) | 추가 | ||
| 3 M NaCl | 175.3 g | ||
| 0.3 M 나 시트르산 | 88.2 g | ||
| 노트: 1.0 L 볼륨을가지고 RNase 무료 물 약 800 mL에 혼합. PH 4.5와 오토 클레이 브를 조정 합니다. | |||
| MgCl2 (50ml) / 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 버퍼 | 추가 | ||
| 1 M NaCl | 5.0 mL | ||
| 1 M Tris, pH 9.5 | 5.0 mL | ||
| 20% 트윈-20 | 1.25 mL | ||
| RNase 무료 물 | 38.75 mL | ||
| 노트: 50 mL 튜브에서 사용 직전 준비. | |||
| 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 버퍼 (100 mL) | 추가 | ||
| 1 M NaCl | 10.0 mL | ||
| 1 M MgCl2 | 5 mL | ||
| 1 M Tris, pH 9.5 | 10 mL | ||
| 20% 트윈-20 | 2.5 mL | ||
| RNase 무료 물 | 72.5 mL | ||
| 노트: 50 mL 튜브에서 사용 직전 준비. 솔루션 것입니다 몇 시간 후 흐린 되 하 고 효소 반응에 대 한 작업을 더 이상 것입니다. | |||
| AP 기판 솔루션 | 추가 | ||
| Ap 통신 버퍼 | 25 mL | ||
| NBT | 82.5 uL | ||
| BCIP | 82.5 uL | ||
| 노트:이 BM 보라색 대신 사용할 수 있습니다. 50 mL 튜브에서 사용 직전 준비. 호 일에 관을 취재 하 고 낮은 조명에서 준비 하 여 어둠 속에서이 솔루션을 유지. | |||
| 가수분해 K 재고 솔루션 (10 mg/mL) | 추가 | ||
| 가수분해 K | 10 mg | ||
| RNase 무료 물 | 10 mL | ||
| 노트: 약 수와-20 ° c.에 게 | |||
| 가수분해 K 솔루션 작업 | 추가 | ||
| 가수분해 K 재고 솔루션 | 90 ul | ||
| 1 X PBS | 18 mL | ||
| 노트: 그냥 최상의 결과 위해 사용 하기 전에 확인 합니다. | |||
| 0.2% 글리신-PBS 솔루션 | 추가 | ||
| 10 X PBS | 45 mL | ||
| RNase 무료 물 | 405 mL | ||
| 글리신 | 1 g | ||
| 노트: 압력가 마로 소독 한 유리 용기에 준비. 글리신은 완전히 용 해 될 때까지 stirer 접시에 실 온에서 혼합. | |||
| Boehringer 임 차단 버퍼 (30 mL) (파 세척 및 블록 버퍼 집합의 일부) | 추가 | ||
| 해결책을 막는 x 10 | 3 mL | ||
| maleic 산 버퍼 x 1 | 27 mL | ||
| 노트: 단지 최상의 결과 위해 사용 하기 전에 확인. 재고 차단 솔루션와 maleic 산 버퍼에서 사용 되었다에서 "발굴 세척 및 블록-버퍼 집합". | |||
| 4 X SSC-50 %formamide (30 mL) | 추가 | ||
| 20 X SSC | 6 mL | ||
| 50% formamide | 24 mL | ||
| 노트: 50 mL 튜브에 사용 직전 준비. 실험실 후드를 준비 합니다. | |||
| 글리세롤 설치 미디어 | 추가 | ||
| 50 mM Tris, pH 8.4 | 80 Μ L | ||
| 글리세롤 | 20 Μ L | ||
표 1: 수행에 대 한 솔루션 주식 제자리에서 교 잡. 테이블은이 프로토콜에 필요한 다양 한 재고 솔루션의 목록입니다. 총 금액은 약 2 슬라이드 우편물의 성능에 대 한 견적 된다. 처리 중인 슬라이드의 금액에 따라 총 금액을 조정 하는 것이 좋습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜에서 설명 하는 방법은 의료 및 진화 발달 연구8,9,10,,1217이전 작품에서 수정 되었습니다. 이 프로토콜 발굴 표시 된 RNA 안티 감각 프로브는 보존 되 고 파라핀에 포함 된 성인 산호에 제자리에 하이브리드의 뉘앙스에 집중 한다. 이 메서드는 파라핀 포함 된 또한 산호 넘어 생물의 샘플을 쉽게 전송할 수 있습니다. 마지막으로,이 방법은 세포 배양, 또는 산호 (예를 들어, 유 충)의 다른 생활 단계 수행할 수 있습니다. 하지만 정확한 프로토콜 이러한 유형의 샘플은 항상 파라핀 포함5,6 이후 다를 수 있습니다. .
가수분해 K 치료, 조사의 교 잡 및 프로브 색상 개발을 포함 하 여이 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 가수분해 K 치료 하는 동안 타이밍은 매우 중요 하다. 치료 제안 보다 긴 경우 조직 저하 및 손상 될 수 있습니다. 또한, K 가수분해 반응의 중지는 지정 된 지점에서 풀 타임에서 수행 되어야 합니다. 그것은 또한 일정 한 교 잡 온도에서 샘플을 유지 하는 중요 한 온도 저하로 수 비 특정 바인딩 탐사선의 원인과 결과 복잡 하 게. 프로브에서 세척 할 경우 모두 한 번에 슬라이드 낮은 온도에서 프로브와 교배 하지 않습니다 보장 하기 보다는 한 번에 하나 교 잡 오븐 각 슬라이드를 중요 하다. 또한, 프로브 교 잡 후 슬라이드의 철저 한 씻기 비 특정 바인딩 방지 도움이 됩니다. 마지막으로, 프로브 색상 개발이이 과정의 가장 중요 한 아직 주관적인 단계 중 하나입니다. 색상 개발은 쉽게 지나치게 하거나 너무 빨리 중단 될 수 있습니다. 이 단계는 인내심을 필요로 하 고 그 이상 슬라이드의 얼룩 되도록 경계 발생 하지 않습니다.
이 프로토콜을 문제 해결의 단계 수 발굴 프로세스 수 있습니다. 부정적인 결과 산출 하는 프로토콜 경우 항 감 (그리고 하지 감각) 다는 것을 확인 하는 프로브를 검사 하 여 시작 하는 것이 좋습니다 프로브. 또한, 솔루션 오래 된 경우에, 그것은 가치가 remaking 또는 그래서 그들은이 프로토콜을 수행할 때 신선한 그들을 대체입니다. 프로브 교 잡 또는 배경 및 일반적인 얼룩의 양을 감소의 기회를 높이기 위해 수정, 교 잡 및 차단, 길이 등을 구현할 수 있습니다. 이 프로토콜의 단계의 높은 숫자 때문에 그것은 추적; 잃고 쉽게 있을 수 있습니다. 따라서, 그것은 조직 유지 하 고 추적 하는 프로토콜의 부분을 완료 하는 것이 중요입니다. 또한, 그것은 아무 단계는 생략 하 고 그 시간 동안에 외피와 세척 줄이려고 하지 중요. 엄지손가락의 좋은 규칙 모든 슬라이드 철저 하 게 청소 되도록 짧은 세척 보다 더 허용 하는 것입니다.
이 방법의 가장 큰 한계는 결과 정량 되지 않습니다. 이 질적 방법입니다, 조직학, transcriptomics, proteomics, 등 다른 방법으로 콘서트에 매우 유익 하다. 시각화 동안 주관적인 시간 뿐만 아니라 교 잡 시간에 있는 변이 때문에 얼룩이 지기의 강도 측정 하지 쉽게 수행 됩니다. 그것은 더 큰 강도 보여줍니다 하지만 진 식 금액을 확인할 수 없습니다 (같은 색상 개발 허용 되는 시간)이이 프로토콜에 있는 변이 때문 프로브를 더 높게 표현 말을 유혹.
이 기술은 생물학에서; 새로운 방법이 아니다. 그러나, 그것은 성인 산호에 매우 자주 수행 하지입니다. 때문에 유전자 표현 데이터는 조직에 앵커 또는 셀 입력11성인 산호에이 메서드를 사용 하 여 매우 강력 하다. Transcriptomics와 게놈 되 고 인기 있는 하 고 강력한 도구 산호 생물학; 그러나, 이러한 방법은 전체 동물의 homogenates에서 일반적으로 수행 됩니다. 이것은 도전 산호의 부분은 관심사의 유전자를 표현 하 고 있다 식별 하 고 따라서 더 많은 도전 하는 실제 메커니즘을 이해. 분에 유전자 표현 데이터, 사용을 통해 유전자 표현 어디 고 어느 정도 더 전체적인 접근 방식을 구현할 수 있습니다. 이 크게 성인 산호에 다른 스트레스 반응 경로 대 한 책임 메커니즘의 이해에 도움이 됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 수상에 의해 투자 되었다 아니. OCE-버로우즈 Wellcome 펀드 박사 농축 프로그램에서 국립 과학 재단 해양 과학 박사 친목 및 수상 no.1012629 통해 1323652.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
References
- Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933 (2003).
- Chen, P. -Y., Chen, C. -C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742 (2007).
- Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).
- Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).
- Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).
- Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
- In situ hybridization protocols. Darby, I. A., Hewitson, T. D. , Humuna Press. Towtowa, New Jersey. (2006).
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization. , Oxford University Press. (1987).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
- Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
- Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).
- Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
- Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).
- Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).
- Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).
