その場で交配 (っぽい) プロトコル マウス脳セクションの代替の Pre-mrna スプライシング パターンを検出する短いアンチセンス オリゴヌクレオチドを使用して記述されています。
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方法論記事
代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析
この記事について
サマリー
要約
代替選択的スプライシング (AS) は、ヒトの遺伝子の 90% 以上で発生します。オルタナティブスプ エクソンの表現パターンは多くの場合セル型固有の方法で調整されます。パターンは通常 RT-PCR および RNA シーケンスによって分析される表現としての RNA のサンプルを使用してセルの人口から分離されました。試験では、その場の特定の生物学的構造の表現のパターンとしては、RNAの in situハイブリダイゼーションによる (っぽい) エクソン特異的プローブを用いた実施できます。ただし、代替のエクソン、一般的にエクソン特異的プローブの設計には短すぎるので、ISH のこの特定の使用が制限されています。本報告では、BaseScope、RNA ISH で短いアンチセンス オリゴヌクレオチドを用いる最近開発された技術の使用はマウスの脳のセクションで式パターンとして分析する説明。神経線維腫型 (Nf1) 1 のエクソン 23 a は、短いエクソン エキソン接合プローブがマウスの脳のセクションの RNA っぽい分析に高い特異性と堅牢な交配のシグナルを示すことを説明するために例として使用されます。もっと重要なは、エクソン包含とスキップ特定プローブで検出される信号は確実にNf1エクソン 23a 式マウス脳の別の解剖学的領域での値でスプライス % を計算する使用できます。実験プロトコル、分析としての計算方法が掲載されています。BaseScope 式パターンとしてその場で評価するために強力な新しいツールを提供することが示唆されました。
概要
代替選択的スプライシング (AS) は、mRNA の成熟過程で発生する一般的なプロセスです。このプロセスで、エクソンは成熟した mRNA の差動含めることできます。したがって、AS を介して 1 つの遺伝子コードを生成できる多く Mrna その異なるタンパク質製品。推定されているヒトの遺伝子の 92-94% が代替スプライシング1,2を受けること。パターンをスプライシング異常の代わりに起因する遺伝の突然変異は、多数の疾患、筋萎縮性側索硬化症、筋強直性ジストロフィーがん3,4などにリンクされています。つまり、調査し、人間の病気の新しい治療法を見つけるための代替選択的スプライシング制御機構を理解することが重要。
多くの場合セル型固有の方法で調整されます。特定の生物学的システムでの特定の遺伝子として発現パターンを調べることが重要です。しかし、これは脳や心臓などの細胞の多くの異なる種類を含む複雑な器官を学んだとき複雑になります。この場合、アッセイ システムの理想的な選択肢は、RNAの in situハイブリダイゼーション (っぽい) ティッシュを使用してセクションの特定の遺伝子として発現パターンを多くの細胞のタイプで同時に検出できます....
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プロトコル
すべての実験では、マウスを含むここに記載は、ケース ウエスタン リザーブ大学機関動物のケアおよび使用委員会によって承認されています。2016-0068 プロトコルのタイトル (PI: 華楼) は、「代替の Pre-mrna スプライシング脊椎動物の発生での役割」.
注意: 装置、試薬およびこのプロトコルで使用される供給のすべての情報は、テーブルの材料に含まれます。
1. ホルマリン固定パラフィン埋め込まれたセクション (FFPE)
-
頚部転位によって 1 の CD1 のマウスと 1 c57bl/6 j マウスを安楽死させます。慎重にカット オープン外科はさみ鉗子とスカル。スコップで脳を削除します。
注: 1 歳 5 か月 CD1 雄マウス 3 ヶ c57bl/6 j マウス使用し、同様の結果を示した。- PBS で脳を洗います。ホルマリン溶液 50 mL に脳全体を置くことによって常温 (RT) 10% ホルマリンを含む溶液で 30 h の脳全体を固定します。
- 定着液を PBS に変更し、4 ° C で一晩 PBS で脳を孵化させなさい脱水、キシレンやパラフィン標準手順18を使用して脳を埋め込みます。
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結果
BaseScope っぽいが 3 つのマウス系統を用いたを行った: CD1 野生型マウス、c57bl/6 j 野生型マウスとNf123aIN/23aIN変異マウス c57bl/6 j バック グラウンドでどのエクソン 23 a の結果としてすべてのセルのタイプに含まれています設計スプライス部位突然変異14,15。
最初のステップとしてっぽいアッセイ システムを提供する会社の試薬を使用してテストされた: 3T3 細胞と陰性と陽性があるスライドっぽいプローブします。図 3に示すとおり、ポジティブ コントロール プローブを使用した場合、多くの点状のドットが検出された一方、陰性コントロール プローブを使用した場合、信号は検出されません。
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ディスカッション
この通信は、マウスの脳のセクションでの発現パターンを検討する BaseScope RNA っぽいの使用を報告します。そのアンチセンス エクソン エキソン接合プローブ エクソン包含およびしっかりと具体的にアイソ フォームをスキップを標的に 50 のヌクレオチドより短いことを示しています。さらに、結果として得られる信号は代替エクソンの PSI を計算する使用できます。
いくつかのバリエーションは、手順でテストされました。たとえば、クライオスタット切片によって生成される凍結するティッシュ セクションおよびこのっぽいプロトコルで使用するために成功するために示されているテストされました。ただし、この場合、2.1 に deparaffinization ステップは、5 分を PBS で 10 月の洗濯に変更されました。さらに、ACD によって提供されるハイブリダイゼーション オーブンを使用すると非常に便利ですが、染色、免疫組織化学用トレイ スライドと組み合わせて 40 ° C で設定簡単なインキュベーターの使用は、同等の結果を与えます。重要なことは、ボックスでプロシージャ全体で湿式ろ紙を含める.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品は、アメリカの心臓協会 [HL を費 0365274B] によって支えられた国立がん研究所 [Z.W. に GI 胞子 P50CA150964] 国立衛生研究 [オフィスの研究インフラ共有計装グラント S10RR031845 にケース ウエスタン リザーブ大学の施設をイメージング、光学顕微鏡 】、【 名大 】 を中国奨学金理事会。
著者は彼の助けの光顕微鏡イメージング コア スライドのスキャニングとリチャード ・ リーをありがとうございます。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| ハイブリダイゼーションオーブン | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| 湿度制御トレイ(蓋付き) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| インペリアルIII汎用インキュベータ | ラボライン | 302 | |
| スライドスキャナー | ライカ | SCN400 | |
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| 試薬 | |||
| <ストロング>前処理キット | アドバンスドセルダイアグノスティック | ス 322381 | |
| 酸化水素 | アドバンスドセルダイアグノスティック | 2000899 | |
| テアーゼIII* | アドバンストセルダイアグノスティック | 2000901 | |
| 10x ターゲットリトリーバル | アドバンスドセルダイアグニ | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | アドバンスドセルダイアグノスティック | 332910 | |
| AMP 0 | アドバンスト セル診断 | 2001814 | |
| AMP 1 | ト セル診断 | 2001815 | |
| AMP 2 | ド セル診断 | 2001816 | |
| AMP 3 | アドバンスト セル診断 | 3 | |
| AMP 4 | アドバンスド セル診断 | 16229B | |
| AMP 5-RED | アドバンスト・セル・ダイアグノスティック | 16229C | |
| AMP 6-RED | アドバンスド・セル・ダイアグノスティック | 2001820 | |
| ファスト・レッド-A | アドバンスド・セル・ダイアグノ | 2001821 | |
| ファスト・レッド-B | アドバンスド・セル・ダイアグノスティック | 16230F | |
| 50x ウォッシュ・バッファー | アドバンスト・セル・ダイアグノスティックス | 310091 | |
| ネガティブ・コントロール・プローブ- マウス DapB-1ZZ | アドバンストセルダイアグノスティック | 701021 | |
| ポジティブコントロールプローブ-マウス (mm)-PPIB-1ZZ | アドバンストセルダイアグノスティック | ス 701081 | |
| コントロールスライドマウス 3T3細胞ペレット | アドバンスドセルダイアグノスティックス | 310045 | |
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| その他の消耗品 | |||
| 加湿紙 | 高度な細胞診断 | 310015 | |
| 洗浄ラック | アメリカンマスターテック サイエンティフィック | 9837976 | |
| ウォッシングディッシュ | アメリカンマスターテック サイエンティフィック | LWS20WH | |
| 疎水性バリアペン | ベクトル研究所 | H-4000 | |
| スライドガラス | フィッシャーサイエンティフィック | 12-550-15 | |
| カバーガラス、24 mm x 50 mm | フィッシャーサイエンティフィック | 12--545-F | |
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| Chemicals | |||
| 水酸化アンモニウム | フィッシャー・サイエンティフィ | 002689 | |
| 100% エタノール (EtOH) | デコン ラボ | 2805 | |
| ホルムアルド溶液 | フィッシャー・サイエンティフィック | SF94-4 | |
| ヘマトキシリン I | アメリカン・マスター・テック サイエンティフィック | 17012359 | |
| マウンティング ミディアム | ベクター ラボ | H-5000 | |
| キシレン | フィッシャーサイエンティフィック | 173942 |
参考文献
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcrip....
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再版と許可
