מיקרו-RNAs (miRNAs) הם רצפי RNA הומולוגי מאוד וקצר, הגשה הרגולטורים post-transcriptional RNAs שליח (mRNAs). שיטות איתור miRNA הנוכחית להשתנות רגישות. אנו מתארים פרוטוקול המשלבת בחיי עיר הכלאה immunostaining לגילוי בו-זמניות של מולקולות miRNA וחלבון במקטעי רקמת הלב העכבר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
MiRNA רקמות ספציפיות ביטוי פרופיל בהלב העכבר באמצעות סעיפים באתרו של הכלאה
במאמר זה
סיכום
תקציר
מיקרו-RNAs (miRNAs) הן תעתיקים RNA חד-גדילי לאגד RNAs שליח (mRNAs) ו לעכב את התרגום שלהם או לקדם את שפלותם. עד כה, miRNAs היו מעורבים מספר רב של תהליכים ביולוגיים ומחלות, אשר יש למסומן את הצורך בשיטות זיהוי אמין של תעתיקים miRNA. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט לגילוי התווית על-ידי digoxigenin (מחדירים) נעולים חומצת גרעין (מגבר קדם) המבוסס על בדיקה miRNA, בשילוב עם חלבון immunostaining על העכבר לב חלקים. ראשית, אנו לבצע בחיי עיר הכלאה טכניקה באמצעות המכשיר לזיהוי miRNA-182 ביטוי בסעיפים הלב של שליטה ועכברים היפרטרופיה. הבא, נוכל לבצע immunostaining לב החלבונים טרופונין T (cTnT), על הסעיפים זהה, כדי להתאים לשפה משותפת miRNA-182 עם תאי cardiomyocyte. באמצעות פרוטוקול זה, היינו מסוגלים לזהות miRNA-182 דרך phosphatase אלקליין המבוסס על ערכי צבע מוחלטים assay, cTnT דרך מכתים פלורסנט. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות את הביטוי של כל miRNA עניין באמצעות מגבר קדם התווית על-ידי החפירה הגששים, וביטוי חלבון הרלוונטיים במקטעי רקמת הלב העכבר.
מבוא
מיקרו-RNAs (miRNAs) הם קצרים (18 – 25 נוקלאוטידים), RNAs חד-גדילי, noncoding המתפקדים הרגולטורים שלילי של ביטוי גנים ברמת post-transcriptional על ידי עיכוב תרגום RNA שליח (mRNA) ו/או קידום mRNA השפלה 1. miRNAs הם עיבד אינטרונים או exons של קידוד או noncoding גנים והם ביקע בגרעין על-ידי DROSHA, כדי קודמן miRNAs (pre-miRNAs), אשר הם גזע-לולאת מבנים של נוקלאוטידים 702. בעקבות cytoplasmic לייצא, pre-miRNAs מעובדים נוספים על ידי לטעמים לתוך miRNAs בוגרת המתפרסים על פני 18 – 25 נוקלאוטידים3,4. לאחר מכן, המתחם שתיקה RNA-induced (RISC) משלבת miRNAs האלה כמו RNAs חד-גדילי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
העכבר דגימות רקמות הלב במחקר זה התקבלו בדרישות הרלוונטיות חוקים והנחיות מוסדיים ואושרו על-ידי ייל אוניברסיטת אכפת חיה המוסדית והוועדה שימוש.
1. פתרון הכנה
- הכנת RNase ddH חינם2O, על ידי טיפול 5 L של ddH2O עם 5 מ של 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC) בין לילה (O/N), בטמפרטורת החדר (RT). אוטוקלב (121 מעלות צלזיוס) כדי לבטל את DEPC. שימוש ddH שטופלו DEPC2O עבור ההכנה של פתרונות במורד הזרם כמו מצוינת.
התראה: DEPC הוא חומר מסרטן ידוע, לטפל רק בשכונה fume. - להכין 1 x פוספט Buffered מלוחים (PBS) פתרון על ידי המסת טבליות PBS 5 ב- 1 ליטר של ddH שטופלו DEPC2או אוטוקלב (121 מעלות צלזיוס).<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
miRNA בחיי עיר הכלאה אופטימלי במקטעי הלב העכבר באמצעות לטרוף miRNA U6-snRNA, אשר שימש ואתאיזם הפקדים בהתאמה. צביעת חיובי מסומן בכחול, בעוד ההכתמה שלילי הוא הצביע על ידי חוסר צבע פיתוח (איור 1A-1B). Cardiomyocyte ביטוי מסוים של miRNA-182 הוערכה בסעיפים הלב של שליטה ועכברים overexpressing PlGF. העכברים נושאת את transgene PlGF תחת מקדם αMHC מפתחים היפרטרופיה, משני אנגיוגנזה מוגברת, בתוך 6 שבועות של הפעלת transgene26
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
זיהוי תעתיק miRNA יכולה להיות מושגת באמצעות טכניקות שונות המשתנות רגישות, ירידה לפרטים, כוח כמותית. . הנה, נדגים את צימוד miRNA בחיי עיר הכלאה עם immunostaining. ומתארות פרוטוקול המאפשר להערכת בו-זמניות של רמות הביטוי של מולקולות miRNA, חלבון, על הלב הנוכשה. אנו הראשונים מראים כיצד לבצע בחיי עיר הכלאה של התווית על-ידי החפירה מגבר קדם miRNA הגששים במקטעי הלב פרפין מוטבע. בשלב הבא, אנו נתאר כיצד לבצע immunostaining עבור cTnT על הסעיפים זהה. לבסוף, נדגים כיצד למזג את צבע שנוצר ואת התמונות פלורסנט. פרוטוקול.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
ברצוננו להודות אנטאנאסיוס Papangelis, על תגובות ביקורתיות על כתב היד. FM נתמך על-ידי ביוטכנולוגיה ו מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BBSRC; BB/M009424/1). IP נתמך על ידי האמריקאי הלב האגודה מדען פיתוח המענק (17SDG33060002).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| דיאתילפירוקרבונט | סיגמא אולדריץ | ' D5758 | DEPC |
| פוספט חוצץ מלח | סיגמא אולדריץ' | P4417 | PBS |
| Tween-20 | פעילי שטח לא יוני | AB02038 | ביואנליטי |
| Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | |
| Proteinase K, רקומביננטי, סיגמא | אולדריץ' | 3115879001 | ProK |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | PFA |
| נתרן כלורי | ThermoFisher | S271 | NaCl |
| מגנזיום כלוריד הקסהידראט | ThermoFisher | M33 | MgCl2 |
| Tris | Sigma Aldrich | T6066 | |
| תמיסת חומצה הידרוכלורית, 1 N | ThermoFisher | SA48 | HCl |
| תמיסת חומצה הידרוכלורית, 12 N | ThermoFisher | S25358 | HCl |
| 1-Methylimidazole | Sigma Aldrich | 336092 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | 39391 | EDC |
| תמיסת מי חמצן H2O2 | Sigma Aldrich | 216763 | H2O2 |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804 | נתרן ציטראט |
| miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) | Qiagen | 339450 | ערבול miRNA/U6 snRNA |
| miRCURY LNA mmu-miR-182 בדיקה לזיהוי | QIagen | YD00615701 | 5'-DIG ו-3'-DIG שכותרתו |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742 | |
| סרום בקר אלבומין | סיגמא Aldrich | A9647 | טבליות BSA |
| NBT/BCIP | סיגמא אולדריץ' | 11697471001 | NBT-BCIP |
| אשלגן כלורי | ThermoFisher | P217 | KCl |
| תמיסת DAPI (1 מ"ג/מ"ל) | ThermoFisher | 62248 | |
| DAPI כיסוי זכוכית | ThermoFisher | 12-545E | כיסוי זכוכית |
| כיסוי פלסטיק | Grace Bio-Labs | HS40 22 מ"מX40 מ"מX0.25 מ"מ | RNA-ase כיסוי פלסטיק |
| ללא אנטי-Digoxigenin-AP, שברי Fab | Sigma Aldrich | 11093274910 | DIG נוגדן |
| מחסום הידרופובי Vector | Laboratories | H-4000 | עט פאפ |
| נוגדן אנטי לב טרופונין T נוגדן | Abcam | ab92546 | cTnT נוגדן |
| עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-11011 | אנטי-ארנב-568 נוגדן |
| Dako פלואורסצנטי הרכבה בינוני | DAKO | S3023 | הרכבה בינונית |
| סרום כבשים | סיגמא אולדריץ' | S3772 | |
| סרום עיזים | סיגמא אולדריץ' | G9023 | |
| פורמיד אמריקאי נטול יונים | |||
| ThermoFisher | UVP HB-1000 Hybridizer |
מקורות
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
- Hu....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
