ويصف هذا البروتوكول تقنية باستخدام الماوس سبلينوسيتيس لاكتشاف أنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة التي تغير التعبير الجيني الجزيئي على مدار الساعة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخدام الماوس سبلينوسيتيس لتقييم تأثير نمط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة في التعبير الجيني على مدار الساعة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
من السلوك للتعبير الجيني، تنظيم إيقاعات circadian تقريبا جميع جوانب علم وظائف الأعضاء. وهنا، نقدم منهجية لتحدي سبلينوسيتيس الماوس مع أنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة (بامبس) lipopolysaccharide (LPS)، ODN1826، وقتل الحرارة الليستريه المستوحدة ، ودراسة أثرها على الجزيئية الإيقاعية على مدار الساعة. سابقا، وقد ركزت الدراسات على دراسة تأثير لبس على مدار الساعة الجزيئية باستخدام مجموعة متنوعة من النهج في فيفو و السابقين فيفو من مجموعة متنوعة نماذج (مثل الماوس وفار، والإنسان). ويصف هذا البروتوكول بالعزلة والتحدي سبلينوسيتيس، فضلا عن المنهجية لتقييم ساعة الجينات التعبير التحدي فيما بعد عن طريق PCR الكمي. يمكن استخدام هذا النهج لتقييم ليس فقط تأثير العناصر الجرثومية على مدار الساعة الجزيئية لكن الجزيئات الأخرى، فضلا عن أنه قد يغير التعبير على مدار الساعة. ويمكن استخدام هذا النهج في ندف أربا الآلية الجزيئية لكيفية تأثير تفاعل مستقبلات بمب-عدد القتلى-مثل التعبير على مدار الساعة.
المقدمة
الساعة الرئيسية في الثدييات، الذي ينظم ذبذبات ح 24 لما يقرب من جميع الجوانب لعلم وظائف الأعضاء والسلوك، يقع داخل نواة suprachiasmatic (SCN)1،تحت المهاد2. وبالإضافة إلى تنظيم العمليات البيولوجية على المستوى العضوي، مزامنة الساعة الرئيسية أيضا الطرفية الساعات الخلوية في جميع أنحاء الجسم3،،من45. بينما تتألف الآلية الجزيئية على مدار الساعة من على الأقل ثلاث حلقات التغذية المرتدة النسخي متعدية المتشابكة، نواة تتكون من الفترة (Per1-3)، كريبتوتشرومي (Cry1-2)، Bmal1، و على مدار....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أثناء الدراسة، ورعاية الحيوان ومعاملة الامتثال لسياسة "المعاهد الوطنية للصحة"، تم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية، وأقرتها جامعة هارتفورد الحيوان رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة.
1-الرائعة للحيوانات
ملاحظة: تستخدم الفئران الذكور B6129SF2/ي عشرين أسبوع في الدراسة.
- الظلام 12 ح دورة لمدة أسبوعين قبل التجربة/انترين الفئران إلى ح 12 خفيفة (البيضاء الخفيفة النفقات العامة القياسية).
ملاحظة: هنا وقت زيتجيبير (ZT) 0 يناظر إلى ZT12 وأضواء على الأنوار، مع الحفاظ على جميع العوامل البيئية الأخرى (أي، من الغذاء والماء، ودرجة حرارة الغرفة) ثابت 21.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
كانت التضحية الفئران في ZT13، سبلينوسيتيس كانت معزولة وتحدي السابقين فيفو بلبس بامبس، ODN1826، أو HKLM. بعد ح 3، تم عزل الحمض النووي الريبي، وكان يستخدم qPCR لتقييم مستويات التعبير النسبي للجينات الجزيئية على مدار الساعة على مدار الساعة، Per2، دبة، و القس erbα مقارنة مع الخلايا التحكم دون منازع. بعد التحدي بمب، مستويات التعبير على مدار الساعة لم تكن تختلف اختلافاً كبيرا من التعبير في الخلايا التحكم (الشكل 1
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ضمن هذا البروتوكول، يمكن استخدامها جهاز المطياف الضوئي ميكروفولومي قياس وتقييم نقاء الجيش الملكي النيبالي المستخدمة في تحديد التعبير الجيني. امتصاص الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة في 260 من الأحماض النووية شمال البحر الأبيض المتوسط، البروتينات عادة تمتص الضوء في 280 نانومتر، بينما الملوثات المحتملة الأخرى المستخدمة أثناء إجراء استخراج الحمض النووي الريبي (مثل الفينول) قابلة للاكتشاف في 230 نيوتن متر. لذلك، بتقييم امتصاص (أ) نسبة في 260/280 نانومتر (الحمض النووي الريبي للبروتين) و 260/230 نيوتن متر (الحمض النووي الر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس له علاقة بالكشف عن صاحب البلاغ.
شكر وتقدير
هذا العمل كان يدعمها المنح "البحثية كلية" من مكتب بكلية الآداب والعلوم عميد في جامعة هارتفورد.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الشرائح المتجمدة | فيشر | 12-550-343 | |
| مصافي الخلايا | فيشر | 22363547 | |
| عديدات السكاريد الدهنية ؛ | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 أو 74106 | |
| RNase Free DNase | Set Qiagen | 79254 | |
| 6 آبار لوحة ثقافة الخلايا | دنفيل | T1006 | |
| 50 مل أنابيب | كورنينج | 352070 | |
| أنابيب 15 مل | كورنينج | 352097 | |
| السعة cDNA النسخ العكسي | كيت ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan مقايسات التعبير الجيني b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| فحوصات التعبير الجيني TaqMan Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan مقايسات التعبير الجيني Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan مقايسات التعبير الجيني Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan فحوصات التعبير الجيني Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR آلة StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp لوحة تفاعل سريعة 96 بئر (0.1 مل) | التحليل | ThermoFisher 4346907 | |
| Prism 7.0a |
المراجع
- Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
- Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
- Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
