利用下一代测序技术对染色体构象捕获环化文库（4C-seq）进行基因调控序列的高通量鉴定

摘要

鉴定基因与调控元件之间的物理相互作用具有挑战性，但染色体构象捕获技术为此提供了便利。该4C-seq方案的改进通过减少PCR模板的过度扩增，减轻了PCR偏好性，同时通过增加限制性内切酶消化步骤，提高了测序读段的可比对性。

摘要

针对特定目的基因，鉴定其调控元件在技术上具有显著挑战性，原因在于调控元件相对于目的基因的位置和效应大小存在较大变异性。通过保守的转录因子结合位点，利用生物信息学方法预测与基因激活表达相关的近端表观遗传修饰的存在及其功能，已取得一定进展。染色质构象捕获技术极大地提升了我们发现序列间乃至全基因组范围内染色质物理相互作用的能力。特别是结合高通量测序的环状染色质构象捕获技术（4C-seq），旨在发现特定目标序列（即“视角序列”，viewpoint）的所有可能的染色质物理相互作用，例如目的基因或调控增强子。目前的4C-seq策略直接从视角序列内部进行测序，但为避免高通量测序平台在碱基识别（成像）过程中出现技术偏差，需同时对大量且多样化的视角序列进行测序。这种实验规模对许多实验室而言可能难以实现。本文报道了一种改进的4C-seq实验方案，该方法引入了额外的限制性内切酶消化步骤以及基于qPCR的扩增步骤，分别旨在提高对多样化序列读长的捕获效率，并减轻PCR扩增可能带来的偏差。我们改进的4C方法适用于常规分子生物学实验室，可用于染色质高级结构的研究。

引言

基因表达调控元件的鉴定得益于DNA元件百科全书（ENCODE）计划，该计划对人类基因组80%的区域进行了功能活性的全面注释^1,2。在特定细胞类型中，体内转录因子结合位点、DNase I超敏感位点以及表观遗传学组蛋白修饰和DNA甲基化修饰位点的鉴定，为靶基因表达相关候选调控元件的功能分析奠定了基础。基于这些发现，我们面临的新挑战是确定调控元件与基因之间的功能互联性。具体而言，一个特定的靶基因与其增强子（们）之间存在怎样的关系？染色质构象捕获技术（3C）通过在固定化的染色质中捕获相互作用事件，直接回答了这一问题，识别出目标区域与候选互作序列之间的物理性且可能具有功能性的相互作用³。然而，随着对染色质相互作用理解的深入，人们认识到仅研究预先选定的候选基因座不足以全面揭示基因与增强子之间的相互作用。例如，ENCODE项目采用高通量染色体构象捕获碳拷贝（5C）方法，仅检测了人类基因组的一小部分（1%，包含44个基因座的试点集合），即发现这些基因座之间存在复杂的互连网络。具有已鉴定相互作用的基因和增强子平均拥有2–4个不同的互作伙伴，其中许多在基因组线性距离上相距达数百千碱基⁴。此外，Li et al. 采用配对末端标签测序法进行染色质相互作用分析（ChIA-PET），研究了全基因组范围内的启动子....

方案

1. 限制性内切酶的选择

1. 确定一个感兴趣区域（例如基因启动子、单核苷酸多态性（SNP）、增强子）并从国家生物技术信息中心（NCBI）等数据库获取DNA序列。
2. 确定用于第一次限制性酶切（RE1）的候选限制性内切酶（REs），这些酶不在目标序列内部进行切割，酶切后产生黏性末端（具有突出端的DNA末端），且其活性不受CpG甲基化的抑制。
   注意：数据的分辨率由RE1决定。识别序列为6个碱基对（bp）的酶平均产生约4千碱基（kb）长度的片段，而识别序列为4个碱基对的酶则产生约250 bp长度的片段，从而能够更精确地鉴定相互作用的序列。
3. 从步骤1.2中确定的候选酶中选择一种RE1，该酶可产生至少500 bp长的“视角”限制性片段，该片段包含目标区域或相邻区域。
   注意：所选酶必须适用于引物设计（见步骤2）。
4. 对于第二次消化，需选择一种具有4 bp识别序列的限制性内切酶（RE2），该酶在消化后产生黏性末端（带有突出端的DNA末端），其活性不受CpG甲基化抑制，并且能在RE1产生的限制性片段内部进行切割，以生成250–500 bp的诱饵片段（图1).
   注意：所选酶必须适用于引物设计（见步骤2）。

2. 设计并验证反向PCR和消化效率qPCR的引物

结果

从2–3份废弃的新生儿包皮组织中分离原代人角质形成细胞，混合后在KSFM培养基中培养，培养基中添加30 µg/mL牛垂体提取物、0.26 ng/mL重组人表皮生长因子和0.09 mM氯化钙（CaCl₂），培养条件为37 °C、5%二氧化碳。将细胞分至两个培养瓶中，其中一瓶通过加入CaCl₂至终浓度1.2 mM诱导分化，持续72小时。分别取10⁷个增殖期和分化期的角质形成细胞，在室温下用1%甲醛固定10分钟。另取K562细胞，在添加10%胎牛血清的RPMI培养基中于37 °C、5%二氧化碳条件下培养，并取10⁷个细胞在室温下用1%甲醛固定10分钟。

细胞被裂解，固定后的染色质按照上述方法用 HindIII 消化并进行连接。逆转交联后，DNA 被纯化并用 CviQI 消化。将 DNA 连接后作为反向 PCR 扩增的模板。所用引物为：5'-GATCAGGAGGGACTGG.......

讨论

4C 结果有可能揭示染色质相互作用，从而鉴定出在特定生物学背景下具有重要功能的先前未知的调控元件和/或靶基因^24,25,26。然而，技术障碍可能会限制这些实验所获得的数据。在 4C 实验流程中，由于模板过度扩增而引起的 PCR 偏倚是可能发生的。本实验方案通过使用 qPCR 客观地确定最佳扩增循环次数，以解决这一问题。此外，通过限制性酶切去除扩增后的反向 PCR 产物中的诱饵序列，可以从两个方面促进染色质相互作用的鉴定：第一，它减少了待测序材料中无信息量的（诱饵）碱基对长度；第二，因此提高了从多样化序列中获得测序读长的可能性（这是准确碱基识别所必需的特性），从而能够比对到更多具有信息量的相互作用序列。其他实验方案需要合并使用不同诱饵序列和/或不同限制性内切酶构建的多个文库，或者需要提高测序样本中 phiX 的浓度，以克服因序列均一性不足而导致的碱基识别困难。本方法允许将多个具有相同诱饵序列的样本合并至单个测序通道中，而无需使用过多的 phiX 占用宝贵.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HindIII	NEB	R0104S
CviQI	NEB	R0639S
DNA寡核苷酸引物	IDT		由读者自行设计
50 mL圆锥形离心管	Fisher Scientific	06-443-19
1.7 mL微量离心管	MidSci	AVSS1700
磷酸盐缓冲液	Thermo Fisher	14190-136
甲醛，无甲醇	Electron Microscopy Sciences	15710
旋转混合仪	VWR	15172-203
甘氨酸	JT Baker	4059-00
台式离心机
制冷微量离心机
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma-Aldrich	ED2SS
20% SDS溶液	Sigma-Aldrich	05030
台盼蓝	Thermo Fisher	15250061
载玻片	Fisher Scientific	12-550-143
盖玻片	VWR	16004-094
光学显微镜
吐温X-100	Alfa Aesar	A16046
振荡加热金属浴
2 M Tris-HCl	Quality Biological	351-048-101
蛋白酶K	NEB	P8107S
苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）	Sigma-Aldrich	P2069
乙酸钠	Sigma-Aldrich	M5661
20 mg/mL糖原	Thermo Fisher	R0561
乙醇	Fisher Scientific	04-355-223
无核酸酶水	Fisher Scientific	MT-46-000-CM
qPCR仪	Thermo Fisher	4453536
qPCR板	Thermo Fisher	4309849
PCR仪	Thermo Fisher	4375786
PCR排管	MidSci	AVSST-FL
1 M氯化镁	Quality Biological	351-033-721
二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	43815
三磷酸腺苷	Sigma-Aldrich	A2383
T4 DNA连接酶	NEB	M0202S
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A6013
RNase A	Thermo Fisher	EN0531
Qiaquick PCR纯化试剂盒	Qiagen	28104
MinElute PCR纯化试剂盒	Qiagen	28004
分光光度计
Expand Long Template PCR体系	Sigma-Aldrich	11681834001
dNTP混合液	Thermo Fisher	R0191
SYBR Green I	Sigma-Aldrich	S9430
ROX	BioRad	172-5858
氯化钠	Sigma-Aldrich	S5886
End-It DNA末端修复试剂盒	Lucigen	ER0720
LigaFast快速DNA连接系统	Promega	M8221
SYBR Safe	Thermo Fisher	S33102
Taq聚合酶	NEB	M0267S
UltraSieve琼脂糖	IBI Scientific	IB70054
Qiaquick凝胶回收试剂盒	Qiagen	28704