High-throughput identificatie van regelgevende gensequenties met behulp van Next-generation Sequencing van circulaire chromosoom conformatie Capture (4C-seq)

Erin A. Brettmann; Inez Y. Oh; Cristina de Guzman Strong

doi:10.3791/58030

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

High-throughput identificatie van regelgevende gensequenties met behulp van Next-generation Sequencing van circulaire chromosoom conformatie Capture (4C-seq)

10.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58030

⸱

5 oktober 2018

Erin A. Brettmann¹ , Inez Y. Oh¹ , Cristina de Guzman Strong¹

¹Division of Dermatology, Center for Pharmacogenomics, Center for the Study of Itch, Department of Medicine, Washington University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

De identificatie van de fysieke interacties tussen genen en regelgevende elementen is uitdagend maar heeft bevorderd door chromosoom conformatie opname methoden. Deze wijziging van het 4C-seq-protocol PCR bias vermindert door het minimaliseren van de over-amplificatie van PCR sjablonen en maximaliseert de mappability van leest door het opnemen van een toevoeging restrictie-enzym digest stap.

Samenvatting

De identificatie van regulerende elementen voor een bepaald doel-gen is een belangrijke technische uitdaging als gevolg van de variabiliteit in de positionering en effect grootte van regelgevende elementen naar een target-gen. Enige vooruitgang is geboekt met de bioinformatic voorspelling van het bestaan en de functie van de proximale epigenetische aanpassingen geactiveerde genexpressie met behulp van geconserveerde transcriptie factor bandplaatsen is gekoppeld. Chromatine conformatie vangen studies hebben een revolutie teweeggebracht in ons vermogen om te ontdekken van fysieke chromatine contacten tussen sequenties en zelfs binnen een gehele genoom. Circulaire chromatine conformatie vastleggen in combinatie met de volgende-generatie sequencing (4C-seq), in het bijzonder, is ontworpen om te ontdekken alle mogelijke fysieke chromatine interacties voor een bepaalde reeks van belang (gezichtspunt), zoals een target-gen of een regelgevende versterker. Huidige 4C-seq strategieën direct opeenvolging van binnen het gezichtspunt maar vereisen talrijke en uiteenlopende standpunten te worden om te voorkomen dat de technische uitdagingen van uniform gelijktijdig sequenced baseren (imaging) bellen met sequencing-platforms van de volgende generatie. Dit volume van experimenten mogelijk niet praktisch voor veel laboratoria. Hier, rapporteren we een gewijzigde aanpak bij het 4C-seq-protocol waarin zowel een extra restrictie-enzym-digest en versterking van de qPCR gebaseerde stappen die zijn ontworpen om een grotere opname van uiteenlopende reeks luidt vergemakkelijken en beperken de mogelijkheden voor PCR bias, respectievelijk. Onze gemodificeerde 4C methode is vatbaar voor de standaard moleculaire biologie lab voor de beoordeling van de chromatine het platform.

Inleiding

De identificatie van regulerende elementen voor genexpressie is bevorderd door de encyclopedie van DNA elementen (CODEER)-Project, dat uitvoerig geannoteerd functionele activiteit voor 80% van het menselijk genoom¹^,². De identificatie van de sites voor in vivo transcription factor binding, DNaseI overgevoeligheid, en epigenetische histone en DNA methylering wijzigingen in afzonderlijke celtypen effende de weg voor de functionele analyses van kandidaat regelgevende elementen voor doel genexpressie. Gewapend met deze bevindingen, worden we geconfronteerd met de uitdaging van de functionele interconnecti....