Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анаэробные роста и поддержания линий клеток млекопитающих

10.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58049

⸱

21 июля 2018 г.

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Midwestern University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы опишем новый метод, позволяющий анаэробных долгосрочные культивирование установленных клеточных линий. Максимальная выживания время, которая была испытана — 17 дней. Этот метод подходит для тестирования цитотоксических агентов и изучения физиологии anoxically репликации клеток.

Аннотация

Наиболее слизистой поверхности вместе с среднее положение в опухоли и ниш стволовых клеток являются географические области тела, которые аноксии. Предыдущие исследования показывают, что инкубации в нормоксические (5% CO2 в воздухе) или гипоксических условий (низкая кислорода) следуют результаты анаэробной инкубации (отсутствие свободного кислорода) в ограниченных жизнеспособности (2-3 дней). Была разработана Роман методология, позволяющая культивирования аноксии клеток (для по крайней мере 17 дней; максимальное время испытания). Наиболее важным аспектом этой методологии заключается в обеспечении, что нет кислорода вводится в систему. Это получается путем дегазации, средств массовой информации и путем промывки трубок и блюда, колбы, пипетки с анаэробной газовой смеси (H2, CO2, N2) следуют разрешительные материалы, чтобы сбалансировать в анаэробных (без кислорода) среде Перед использованием. Дополнительный уход должны осуществляться при приобретении микрофотографии чтобы убедиться, что получены микроскопии не содержат артефакты. В отсутствие кислорода морфологию клеток значительно изменены. Два отдельных Морфотипы отмечены для всех анаэробно выращенные клетки. Возможность расти и поддерживать mammalian клеток в отсутствие кислорода может применяться для анализа физиологии клетки, полимикробная взаимодействий и характеристика биосинтетических пути для развития Роман рака наркотиков.

Введение

Клетки из солидных опухолей, ниши стволовых клеток и те подкладки слизистых поверхностей существуют в средах, которые испытывают снижение кислорода, включая гипоксия1,2,3,4. В нормальной физиологической государствах оксигенации меняется за гипоксии аноксии (полное отсутствие кислорода)5,6. Осознание что атмосферного кислорода отрицательно влияет на репликацию mammalian клетки, и что рост в пробирке клеток могут быть оптимизированы в условиях обедненного кислородом было сообщено в начале 1970-х годов. Рихтер и др. 7 показали, что 1-3% кислорода (гипоксии) повышение эффективности покрытия по сравнению с атмосферным кислородом (20%). Диплоидных клеток человека жизни также распространяется в условиях гипоксических культуры8.

В естественных условиях, гипоксических условий возникают, когда магазины кислорода обедненного (например, во время интенсивных физических упражнений), котором производства АТФ включен в скелетных мышцах от аэробного дыхания для ферментации (анаэробное дыхание) с конечный продукт молочная кислота9. Патологически, в раковой опухоли, интерьер опухоли масса гипоксических для анаэробных из-за плохой васкуляризации10. Эффект ограниченной перфузии на опухоль интерьеры независимо подтверждены опухоли интерьеры колонизирована облигатных анаэробов1. Механически, выживание клетки тумора в гипоксии считается исключительно зависит от экспрессии гена гипоксия индуцибельной фактор 1-альфа (HIF1-альфа), который является первоначальный спонтанной реакцией к гипоксии4,11 , 12. HIF1-альфа в гипоксических условиях индуцируется белков теплового шока, которые связывают HIF1-альфа-промоутер и upregulate транскрипции гена12. Предполагается, что эти белки теплового шока помощи в индукции различных фенотипов, видели в гипоксических микроокружения опухоли. Эти фенотипы exhibit выражение увеличение глюкозы транспортеров клеточной мембраны и интенсивность гликолиза (Варбург эффект)13. Результатом является переход от митохондриальной окислительного фосфорилирования в кислоты брожения.

Аноксии выживания может также использовать альтернативы глюкозы для поддержки выживания явление14,15. Наилучшим учился млекопитающих примером является землекоп, которые могут выжить в течение почти 20 минут без кислорода через фруктоза driven гликолитических ферментации путь14. Альтернативные адаптации происходит в некоторых рыб (например, карп [караси sp.], которые могут выжить в течение значительно дольше периоды времени, с использованием гликолиз с этанолом как субпродукт терминала)15. В обоих случаях ферментация диски метаболизма, позволяя выживания в отсутствие кислорода. Текущий гипотеза для анаэробных выживание является то, что так долго как HIF1-альфа активируется при гипоксии, митохондриальное дыхание, без необходимости для кислорода, происходит в анаэробных условиях16. Кроме того это постулируется, что использование ферментативным путь аноксии/гипоксии выживания улучшает выживания опухоли, поскольку клетки избежать Оксидативный стресс, который может оказаться пагубным для выживания клетки17. Этот постулат поддерживается недавнего исследования, которое показывает, что в кардиомиоцитов, гипоксия уменьшает окислительного стресса на клетки опухоли17.

На сегодняшний день, основополагающий характер ферментативным пути для выживания аноксии mammalian клетки было укоренилось в литературе, должным образом, в значительной степени, неспособность культуры mammalian клеток в условиях полного отсутствия кислорода для более чем 3 дней. Однако альтернативой гликолиз для анаэробных выживания происходит в бактерии. В некоторых бактерий азот или сульфат (среди других соединений) может служить акцепторами терминала электронов для системы цитохрома оксидазы в отсутствие кислорода18. Хотя параллельно бактерий и эукариот эволюции момента отхода от последнего общего предка универсальный, подсчитано, что митохондрии обеспечение энергии для клеток 1.542 миллионов лет до оксигенации океанов19 . Так как исследователи показали, что изолированных митохондриях может производить АТФ в отсутствие кислорода, с нитрита как терминал электрон акцептора, это разумно предположить, что клетки могут функционировать для периодов времени, более чем 3 дней в отсутствие кислорода 20 , 21 , 22 , 23. по методике, описанной в этом исследовании есть утилита для роста анаэробных mammalian клетки многочисленных клеточных линий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовьте СМИ анаэробные культуры различных линий клеток млекопитающих

  1. Сделайте полный PS-74656 средство для анаэробных клетки культуры25.
    1. Стоковый раствор стерильной Нитритная (5 М; 100 x), растворяя 17.25 g нитрита в 50 мл дистиллированной деионизированной воды, а затем фильтр следует стерилизовать его.
    2. Добавить 0,5 мл Стоковый раствор нитрита в 50 мл низкий глюкозы DMEM (1 г/Л глюкозы) с 110 мг/Л L-глютамином, 584 мг/Л пируват натрия, и 10% плода бычьим сывороточным (ФБС; инактивированная тепла).
      Примечание: Использование FBS концентрации более чем на 10% являются токсичными. Следует отметить одна линия клетки рака испытания имели низкий допуск для СМИ с нитритов (MDA-MB-231, линии клеток рака молочной железы) и, таким образом, был выращен в отсутствие нитрита. Кроме того хотя PS-74656 среднего роста всех клеточных линий, которые были протестированы (n = 9), некоторые клеточные линии (например, клеток Веро) выставлены более высокие концентрации клеток и более высокой жизнеспособности в PS-74656 с высоким глюкозы (4,5 г/Л) DMEM 25.
    3. Место 20 мл средства в стерильных 50 мл конические пластиковых пробирок. Не завинчивайте крышку; Она должна быть свободной.
    4. Де газовой среды, поставив трубку в вакуумной колпаком на примерно под углом 45 °, чтобы максимизировать средней площади поверхности.
    5. Применение вакуума с помощью вакуумного насоса, или его эквивалент, при комнатной температуре. Поддерживать вакуум до тех пор, пока пузырьки больше не соблюдаются (24-48 ч).
    6. Снять трубку из кувшина и немедленно закройте крышку, герметизации труб для сведения к минимуму введение воздуха в средних.
    7. Место труб в зале коммерческого анаэробных.
    8. Ослабьте крышку трубки и позволяют атмосферу в трубку, чтобы сбалансировать с этим анаэробных газовой смеси в камере по крайней мере 24 часа.
      Примечание: Носитель должен оставаться в камере до тех пор, пока он используется. Для ускорения процесса, скрытой трубки по крайней мере 3 x с анаэробной газовой смеси с помощью пипетки стерильные передачи заполнены с анаэробной газ, который состоит из H2, CO2и N2.
    9. Дега все трубы (10-15 мин) помещается в анаэробных камеру, как описано выше до герметизации трубки и размещение в камере. Перед использованием промойте в анаэробных газовой смеси с помощью пипетки передачи 1,5 – 2 мл или пипетки советы, которые были сброшены с анаэробной газа по крайней мере 3 x.
    10. Находясь в анаэробные камеры, удалить 100 мкл средне-стерильные дегазацию микро пластиковых пробирок и проверить его на растворенного кислорода с помощью датчика кислорода в камере.
      Примечание: Электрод кислорода откалиброван на производителя протокол до использования. Чтений должным образом дегазации и уравновешенной анаэробных газовой смеси СМИ равны 0.
      Предупреждение: Если показания находятся выше 0,3 ppm кислорода, по-прежнему инкубировать СМИ в анаэробные камеры, поскольку требуется больше времени, чтобы сбалансировать среды.

2. аноксии выращивания различных линий клеток млекопитающих

  1. Назначенный день -1
    1. Рост клеток (37 ° C, 5% CO2) в колбе T150 до 90% слияния для анаэробных и нормоксические культуры управления предоставить достаточное количество клеток для трех 24-ну пластин (80% слияния).
      Примечание: Для этого исследования, были использованы клетки HeLa 229 и Vero. Этот протокол также проверены и оказались успешными для роста и поддержания семи других клеток линии25.
    2. Удалите носитель из колбы стремлением и мыть его с 10 мл HBSS.
    3. Замените носитель с 5 мл трипсина. Агитируйте колбу до тех пор, пока клетки визуально отделить от пластика. Аспирационная большинство трипсина, а затем коснитесь колбу выбить адэрентных клеток. Добавить 10-15 мл высокой глюкозы DMEM (4,5 г/Л глюкозы, 110 мг/Л Л-глутамина, 10% FBS, 50 мкг/мл гентамицина) для инактивации трипсина.
    4. Нарезанных клетки с помощью пипетки 25 мл до тех пор, пока все кусты клетки разрушаются.
    5. Подсчитать количество ячеек и определить жизнеспособность, используя стандартные Горяева и метод исключения Трипановый синий краситель или автоматизированных эквивалент.
    6. Приостановите клетки в высокой глюкозы DMEM, как упоминалось выше плотность клеток 2.24 x 105 клеток/мл.
    7. Добавить 1 мл суспензии клеток к добрам плиты 24-ну тканевые культуры (2,24 х 105 клеток/хорошо; 80% слияния). Семян 1 пластина для анаэробных культуры и другой для управления нормоксические культуры.
    8. Инкубируйте клетки при 37 ° C в нормоксические условиях (5% CO2) за 24 ч.
      Примечание: Клетки можно покрытием в различных хорошо размера пластины. Однако заполнение ячейки для анаэробных роста в колбах рискует введения кислорода в систему, если это осторожно, чтобы полностью избавиться от атмосферного газа.
  2. Назначенный день 0
    1. После 24 ч инкубации нормоксические Поместите пластины для анаэробных роста в анаэробных камеру (коммерческие анаэробные камеры; Рисунок 1).
    2. Немедленно измените носитель к антибиотикам бесплатно де газированные PS-74656 среда, которая была приспособиться за 24 ч до анаэробные камеры. Установите пластину в контейнер с влажным полотенцем и слабо закройте его для сохранения влаги.
      Примечание: Пластины для роста нормоксические обрабатываются одинаково за исключением, что все процедуры проводятся в атмосферных условиях.
  3. Назначенный день 1
    1. 1 день анаэробной инкубации начинается через 24 ч инкубации в коммерческих анаэробные камеры, которая содержит стандартный анаэробных газовой смеси 10% H2, 10% CO2, и 80% N2.
    2. Инкубируйте клетки для различных периодов времени.
    3. Контролировать анаэробной среды для изменения цвета со временем.
      Примечание: Цвет переход от красно оранжевый Маджента сигналов время изменить средство. Это может занять до 2 недель, чтобы произойти. Цветового сдвига в среде от красно оранжевый желтый указывает на наличие бактериального загрязнения.
    4. Когда носитель изменяется от красного до пурпурного, удалите runagate клетки путем аспирации.
    5. Месте аспирированных отработанного СМИ с runagate клетками в дегазации и анаэробных газах достижение равновесного уровня отцентрифугировать трубы, закройте трубы а убедившись, что печать является безопасным и затем центрифуга их (326 x g; при комнатной температуре в течение 10 мин). Немедленно замените аспирированных СМИ в колодец 1 мл новой дегазацию PS-74656 среды.
    6. Место отцентрифугировать трубка с гранулированных клетки в анаэробные камеры до его открытия. Аспирационная отработанного среднего и заменить его с свежими дегазацию PS-74656 средних и общим объемом 1 мл в трубке отцентрифугировать.
    7. Возвращение клетки из трубки в скважину на пластину 24-ну тканевые культуры.

3. Оценка фенотипические клеточная дифференцировка по микроскопии анаэробно культивируемых клеток

  1. Находясь в анаэробные камеры, установите пластину закрывающейся упоенный анаэробных газовой смеси и закрыть окно.
    Примечание: Поле должно содержать влажной салфеткой для влаги и предотвращения пластину от высыхания. Для микроскопии пакеты для бутербродов работают лучше всего, поскольку они тонкие.
    1. Полностью соблюдать клетки под микроскопом, уплотнение мешок и удалить его из камеры.
    2. Тщательно растягивать пластину пластиковый мешок, изучить клетки с помощью инвертированного микроскопа контраст фазы с вложением камеры и занять микрофотографиями при различных увеличениях.
    3. Возвращение пластину в запечатанном мешке в палату и продолжать инкубацию, как описано в шаге 2.3.3.
    4. Чтобы отдельно анализировать runagate клетки, которые находятся во взвешенном состоянии, выполните шаги, описанные в шаге 2.3.5.
      Примечание: Эти клетки затем может использоваться для тестирования аэробных или могут быть возвращены в анаэробные камеры для тестирования этой конкретной группы населения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Сила настоящего Протокола заключается в своей поддержке долголетия и роста несколько клеточных линий и признания, что существуют глубокие изменения и различия в морфологии клеток25. Наиболее важным элементом данного исследования является передача и поддержания клеток под строгим anaerobiosis. Это требует анаэробные камеры организована максимально протокол (рис. 1) и заверения в том, что клетки удалены для микроскопии или другие тестиро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот метод представляет впервые mammalian клеток, которые были культивировали для длительных периодов времени в отсутствие кислорода. Основываясь на текущих наблюдениях, аноксии роста потенциала через не ферментативную путь представляется универсальный среди mammalian клеток линий28, где анаэробных рост привели к фенотипу расхождения. Это было отмечено для всех клеточных линий испытания. С анаэробного культивирования увеличения доли клеток стал округлые, разработали подвеска как населения...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы благодарят Midwestern университета Управление по исследованиям и поддержке программ за их поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Анаэробная камера Whitney A35Don Whitley Scientific Microbiology InternationalВозможность удаления передней части камеры позволяет легко помещать инструменты внутрь, не беспокоясь о том, что они пройдут через порталы.
CO2 инкубаторFisher Scientific3531
Hood Tissue Culture HoodLabconcoDO55735
пипеткиDrummond4-000-100
стерильные переносные пипеткиSanta Cruzsc-358867
50 cc стерильные конические центрифужные пробиркиDOT451-PG
вакуумная банкаNalgene 111410862889BTA-Mall 5311-0250
DMEM высокий уровень глюкозы (4,5 г/л)CellGro10-017-CM
DMEM низкий уровень глюкозы (1 г/л)CellGro10-014-CV
FBSVWR1500-500
HBSSVWR20-021-CV
трипсинVWR25-052-CI
гентамицинGibco15750-060
стерильные пипеткиCellTreat229210B, 229205B
Колба для культуры тканей (T75 или T150)Santa Cruzsc-200263, sc-200264
24 лунки для обработанных культур тканей посудыDOT667124
рад пакеты для сэндвичей с застежкой-молниейZiplocCostco
микроскоп с инвертированной фазой (10, 20 объективов 40x с камерой монт)Nikon EclipseTS100
трипановый синийInvitrogenT10282
гемоцитометрInvitrogenC10283
Countess Автоматизированный счетчик клеток LifeTechnologiesAMQAF1000
Rainin микротитры пипеткиMettler ToledoRainin Classic Pipette PR-100
микротитры наконечникиSanta Cruz Биотехнологияsc-213233 & sc-201717 
штатив для пробирок (пробирки 50cc)The Lab DepotHS29050A
нитрита натрияSigmahttps://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US
прозрачные коробки с крышкамиRosti MepalRubber maid
бумажные полотенцаВ доме
скребок для клетокCellTreat229310
PBSСобственная подготовка
70% этанолаFisherScientific 64-17-5
стерильныеSanta Cruzsc-200273
с держателем (рабочий стол)Heathrow ScientificHS10320
нитриловые перчаткиVWR89428
кислородный электродeDAQEPO354
pH-метрJenway3510
pH бумага/ pHydrionSigma AldichZ111813
Микроцентрифужные пробирки пакеты для биологической опасности

Ссылки

  1. Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants? Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11(2013).
  2. Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).
  3. Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).
  4. Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).
  5. Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).
  6. Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).
  7. Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
  8. Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423(1977).
  9. Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
  10. Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).
  11. Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).
  12. Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).
  13. Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
  14. Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356 (6335), 307(2017).
  15. Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73(1983).
  16. Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).
  17. Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).
  18. Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).
  19. Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).
  20. Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).
  21. Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).
  22. Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).
  23. Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).
  24. Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).
  25. Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).
  26. Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).
  27. Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).
  28. Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Анаэробное культивирование клетокисключение кислородадегазация средыанаэробная камеражизнеспособность клетоканализ морфотиповмикроскопические артефактывзаимодействия хозяина и патогеначувствительность раковых клеток к препаратамкультивирование стволовых клеток
Анаэробные роста и поддержания линий клеток млекопитающих
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.