本文介绍了一种利用基于生物纳米孔的电子平台在单分子水平检测离散金属氧簇——多金属氧酸盐（POMs）的实验方案。该方法为研究这些分子的传统分析化学工具提供了一种互补手段。
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本文内容
摘要
摘要
通过测量单个纳米级孔道中离子电流因分子通过而产生的减小程度，可以检测并表征单个分子。该信号反映了分子的理化性质及其与孔道的相互作用。我们证明，由细菌蛋白金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）α溶血素（αHL）形成的纳米孔可在单分子水平上检测多金属氧酸盐（POMs，阴离子型金属氧簇）。此外，该方法还能同时测量溶液中12-钨磷酸（PTA，H3PW12O40）多金属氧酸盐的多种降解产物。纳米孔方法的单分子灵敏度使得POMs的表征所需浓度显著低于核磁共振（NMR）波谱法。该技术可为化学家提供一种新工具，用于研究多金属氧酸盐或其他金属簇的分子特性，深入理解POM的合成过程，并可能提高其产率。理论上，该方法还可用于探究分子中特定原子的位置、分子片段的旋转以及金属的氧化态。此外，这一新技术的优势在于能够实时监测溶液中的分子动态。
引言
在单分子水平上检测生物分子分析物可通过使用纳米孔并测量离子电流调制来实现。通常，根据制备方式的不同，纳米孔可分为两类：生物纳米孔（由蛋白质或DNA折纸自组装而成）1,2,3，或固态（例如，使用半导体加工设备制造4,5尽管固态纳米孔被认为在物理上可能更坚固，并可在广泛的溶液条件下使用，但迄今为止，蛋白质纳米孔具有更高的灵敏度、更强的抗污染能力、更大的带宽、更好的化学选择性以及更高的信噪比。
多种蛋白质离子通道，例如由 金黄色葡萄球菌 α-溶血素（αHL）可用于检测单个分子，包括离子（例如，H+ 和 D+)2,3多核苷酸（DNA和RNA）6,7,8，受损的DNA9
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方案
注意： 以下方案专用于Electronic BioSciences（EBS）Nanopatch DC系统。然而，该方案可轻松适配于其他用于测量平面脂质双层膜电流的电生理设备（标准脂质双层膜室、U型管构型、拉制微毛细管， 等等。）。商业材料及其来源的标识仅用于描述实验结果。此标识绝不意味着美国国家标准与技术研究院的推荐，也不意味着这些材料是可获得的最佳选择。
1. 溶液与分析物的制备
- 使用 I 型水纯化系统制备的 18 MΩ-cm 水配制所有电解质溶液，以去除痕量有机物，然后在离子通道记录前立即通过 0.22 μm 真空滤膜过滤所有电解质溶液。
注意： 水质是影响膜纳米孔系统稳定性和使用寿命的关键因素。 - 野生型 αHL。
- 操作 αHL 毒素蛋白时，请遵循材料安全数据表（MSDS）中的安全预防措施。
- 将冻干的野生型单体 S. aureus α-溶血素（αHL）粉末用 18 MΩ-cm 水溶解至浓度为 1 mg/mL。将样品分装为每份 10 至 30 μL，置于耐低温离心管中，迅速在液氮中速冻，随后于 -80 °C 保存。或者，可使用已纯化的预制七聚体 αHL31。
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结果
在过去的二十年中，膜结合蛋白的纳米级孔道已被证明是多功能的单分子传感器。基于纳米孔的测量相对易于实施。两个充满电解质溶液的腔室由嵌入电绝缘脂质膜中的纳米孔分隔开来。通过膜片钳放大器或外部电源在纳米孔两侧施加静电势 通过 浸入电解质储液池中的 Ag/AgCl 电极。电场驱动带电粒子进入纳米孔，导致离子电流发生瞬时减小，该减小程度取决于粒子的尺寸、形状和电荷。计算机程序控制施加的电压，并实时监测因分子可逆地进入纳米孔所引起的离子电流阻断事件。电流信号通过低噪声、高阻抗的场效应晶体管放大并转换为电压信号，再通过数据采集卡进行数字化处理。
本文提供了一种利用生物纳米孔检测多金属氧酸盐（POMs）的通用方法。如图2所示，在未加入POMs时，施加-120 mV电压下未受阻塞的通道平均开放电流约为100 pA。加入POMs后，会产生瞬时阻塞，并使离子电流降低约80%。正如预期，由于这些粒子.......
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讨论
由于具有阴离子电荷，POMs 可能通过静电相互作用与有机反离子结合。因此，确定合适的溶液条件和适当的电解质环境（尤其是溶液中的阳离子）以避免与 POMs 形成复合物显得尤为重要。在缓冲液的选择上需格外谨慎。例如，与磷酸盐缓冲溶液相比，三(羟甲基)氨基甲烷或柠檬酸缓冲溶液中 POMs 的捕获速率显著降低，这可能是因为前两种缓冲液之一会与 POM 形成复合物，从而无法与纳米孔发生强相互作用。此外，特意选用 NaCl 电解质而非 KCl（以及其他碱金属盐），以避免 K+ 引起 [PW11O39]7- 沉淀。
准确测量停留时间分布的关键在于能够以足够高的带宽测量电流。例如，当停留时间呈指数分布时，停留时间短的阻断事件远多于停留时间长的事件，因此通过采集大量数据可更准确地估算停留时间分布即， 以尽可能高的带宽进行采集，该带宽受限于系统电容）。为在纳米孔谱学中实现这一条件，应尽量降低系统电容（包括膜电容和杂散电容）。通过缩短所有连接电缆的长度并使用高质量的电气接触来减少杂散电容。通过减小双.......
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致谢
我们感谢欧洲分子生物学组织（EMBO）提供的博士后奖学金（资助对象：J.E.）以及美国国立卫生研究院国家人类基因组研究所（NIH NHGRI）的资助（资助对象：J.J.K.）。我们感谢哥伦比亚大学的Jingyue Ju教授和Sergey Kalachikov教授提供七聚体αHL，同时也感谢弗吉尼亚联邦大学的Joseph Reiner教授富有启发性的讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 纳米片DC系统 | Electronic Biosciences, Inc., EBS | ||
| Millipore LC-PAK | Millipore 真空滤器 | ||
| 1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱 (DPhPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850356P | |
| 癸烷，试剂级，≥99%， | Sigma-Aldrich | D901 | |
| αHL | List Biological Laboratories, Campbell, CA | ||
| 银丝 | Alfa Aesar | ||
| 2 mm Ag/AgCl 圆盘电极 | In Vivo Metric | E202 | |
| 高阻抗放大器系统 | Electronic Biosciences, San Diego, CA | ||
| 石英毛细管 | |||
| 定制聚碳酸酯测试池 | |||
| 数据处理与分析软件 MOSAIC | https://pages.nist.gov/mosaic/ | ||
| 水合磷钨酸 | Sigma-Aldrich | 455970 | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| 一水合磷酸二氢钠 | Sigma-Aldrich | 71507 |
参考文献
- Ettedgui, J., Kasianowicz, J. J., Balijepalli, A. Single molecule discrimination of heteropolytungstates and their Isomers in solution with a nanometer-scale pore. Journal of the American Chemical Society. 138 (23), 7228-7231 (2016).
- Bezrukov, S., Kasianowicz, J.
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重印与许可
