用于表征蛋白质基水凝胶的力钳流变术

摘要

一种新型的力钳流变测量技术被用于研究固定在音圈电机和力传感器之间的低体积蛋白基水凝胶样品的力学性能。模拟比例-积分-微分（PID）系统可将所受力“钳制”在预设的实验方案范围内。

摘要

本文介绍了一种力钳流变学方法，用于表征基于蛋白质的水凝胶的生物力学特性。该方法采用模拟比例-积分-微分（PID）系统，对固定在直线音圈电机与力传感器之间的圆柱形蛋白质水凝胶样品施加受控的力程序。在运行过程中，PID系统通过最小化测量力与设定力之间的差异，调节水凝胶样品的伸长，以跟踪预设的力程序。这种针对基于蛋白质的水凝胶的独特方法 能够固定体积极小（< 5 µL）且蛋白浓度不同的水凝胶样品。在力斜坡程序下（即施加的应力随时间线性增加和减少），该系统可用于研究与蛋白质（去）折叠相关的弹性与滞后行为，并测量标准的弹性与粘弹性参数。在恒力条件下（即力脉冲呈阶跃状），由力变化引起的弹性响应与来自蛋白质结构域去折叠和再折叠的粘弹性响应得以分离。由于该方法所需样品体积小，且可灵活施加多种机械扰动，力钳流变学技术特别适用于通过整体方法研究蛋白质在受力条件下的力学响应。

引言

除了具有独特的物理特性外，基于蛋白质的水凝胶有望通过在一次“拉伸”中测量数十亿个分子，彻底改变力谱技术，从而实现对类似皮肤及其他组织中拥挤环境下的蛋白质进行研究。蛋白质结构域在水凝胶内部仍保持折叠状态，使其能够研究这些结构域对力学作用、结合伴侣以及化学条件的生物力学响应。此外，蛋白质结构域在水凝胶内的生物力学响应与单分子力谱技术中观察到的响应相似。例如，化学变性剂和氧化剂均会降低折叠态的稳定性，无论是在单个蛋白质结构域水平^1,2,3，还是在宏观水平上^4,5,6,7。同样，渗透保护剂可提高单个蛋白质的稳定性^8,9，在相同受力条件下导致水凝胶的黏弹性响应降低 ^7,10。

已采用多种方法来合成基于蛋白质....

方案

1. 试剂溶液的配制

1. 使用 Tris 缓冲液 [20 mM 三（羟甲基）氨基甲烷和 150 mM NaCl，pH 7.4] 将目标蛋白溶解或稀释至所需浓度，制备起始蛋白溶液。
   注意：能够通过交联形成水凝胶的最低蛋白浓度取决于所用蛋白，通常 > 1 mM。
2. 将过硫酸铵（APS）和三（联吡啶）氯化钌（II）（[Ru(bpy)₃]²⁺）粉末溶于 Tris 缓冲液中，分别配制 1 M APS 和 6.67 mM [Ru(bpy)₃]²⁺ 储存液。

2. 基于蛋白质的水凝胶合成

1. 将带有压紧活塞的23 G针头安装到1 mL注射器上。
2. 使用剃刀切割一段10 cm长的聚四氟乙烯（PTFE）管（内径0.022 in，外径0.044 in）。将针头和注射器连接至PTFE管的一端。
3. 将管子的另一端插入硅烷溶液中，通过回抽注射器活塞使溶液充满管子，静置约30分钟。
4. 移除硅烷溶液，并用压缩空气干燥管子。
   注意：确保所有硅烷溶液均已干燥，且管内无残留物。
5. 将蛋白质溶液与 APS 和 [Ru(bpy)3] 混合²⁺ 在1.5 mL离心管中使用恒定体积比[例如，15:1:1 或 15:0....

结果

图1A展示了用于合成L-EGP/L₈ 水凝胶的光活性反应示意图。图1B显示了聚四氟乙烯（PTFE）管中水凝胶混合物在光活化前后的状态。图1C展示了在Tris溶液中挤出的L-eGFP-L₈水凝胶。水凝胶样品无缺口等结构缺陷。应弃用具有明显损伤的水凝胶。

力钳式流变仪的装配图与分解图分别如图2A和2B所示。图2C展示了力钳式流变仪的示意图，其中水凝胶样品固定在连接线性音圈电机和力传感器的挂钩之间，并浸没在缓冲溶液中。模拟PID系统通过控制线性音圈电机的位置以跟踪设定的力值，从而调节水凝.......

讨论

本文介绍了一种力钳流变学技术，用于研究小体积蛋白基水凝胶的生物力学响应。此外，提供了一种制备均匀圆柱形小体积蛋白水凝胶样品的方案。还给出了一种在不引起蛋白基水凝胶样品机械变形或损伤，以及避免凝胶在挂钩上滑脱的情况下，将具有不同弹性的多种蛋白基水凝胶进行打结的方法。模拟PID系统结合线性音圈电机和力传感器，可实现力 ramp 和恒力等受控力加载程序。最近，该技术已被用于研究在不同实验溶液中不同交联浓度的BSA基水凝胶的生物力学响应⁷。

在配制和使用蛋白质水凝胶时，一个重要的方面是测量结果的可重复性。如果凝胶的蛋白质浓度过低或交联不完全，在拉伸过程中会出现永久性塑性变形。⁷这些塑性变形会严重限制数据的解释，因为粘弹性效应将同时来源于结构域的展开以及凝胶内部的分子重排。一个简单的测试方法可用来判断是否存在这种情况 完全交联的方法是将水凝胶浸入化学变性剂中，例如 6 M 盐酸胍¹在此情况下，应力中不应存在任何粘弹性效应。与

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SI-KG4A 力传感器	World Precision Instruments (WPI)	SI-KG4A
线性音圈电机	Equipement Solutions	LFA2010
牛血清白蛋白	Rocky Mountain Biologicals (RMBIO)	BSA-AAF-1XG / 100 G
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503-1KG
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
过硫酸铵	Sigma-Aldrich	248614-100G
三(联吡啶)氯化钌(II)	Sigma-Aldrich	544981-1G
EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 尼龙缝合线 12根/包	Fisher Scientific	NC0395626
1 mL 注射器（仅针筒），鲁尔锁扣式针头接口	BD	309628
硅烷化试剂 Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-25ML
微孔聚四氟乙烯管，内径 0.022" × 外径 0.042"，100 英尺/卷	Cole-Parmer	EW-06417-21
皮下注射针头，23 号	Healthcare Supply Pros	305194
Jensen Global JG24-1.5X 红色 IT 分液针头 - 24 号	KIMCO	JG24-1.5X
USH-103D USHIO 100 W 短弧汞灯	ALB	USH-103D USHIO
医用镊子
医用剪刀
Olympus
定制部件的计算机代码和 CAD 设计可根据要求向通讯作者索取。