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방법 논문

라벨-무료 3 차원 양적 위상 이미징 사용 하 여 림프 구의 식별 및 기계 학습

11.9K 조회수

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DOI:

10.3791/58305

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2018년 11월 19일

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이 논문에서

요약

우리의 림프 구 정량 위상 이미징 및 기계 학습 알고리즘을 사용 하 여 레이블 없는 식별 프로토콜을 설명 합니다. 림프 톨의 3 차원 굴절률 tomograms의 측정 3D 형태학 및 생화학 정보 개별 셀에 대 한 다음 종류의 식별을 위한 기계 학습 알고리즘으로 분석을 제시.

초록

여기의 림프 구 정량 위상 이미징 및 기계 학습을 사용 하 여 레이블 없는 식별 프로토콜을 설명 합니다. 림프 톨의 식별 진단 면역학의 연구 및 다양 한 질병의 치료에 대 한 중요 하다. 현재, 항 원-항 체 반응을 통해 특정 막 단백질을 라벨에 의존 하는 림프 구 종류를 분류 하기 위한 표준 방법. 그러나, 이러한 라벨 기술을 세포 기능 변경의 잠재적인 위험. 여기에 설명 된 프로토콜 3D 양적 위상 이미징 및 기계 학습 알고리즘에 의해 측정 하는 내장 광학 대조를 이용 하 여 이러한 문제를 극복 한다. 림프 톨의 3 차원 굴절률 (RI) tomograms의 측정 3 차원 형태 및 개별 셀의 고기에 대 한 정량적 인 정보를 제공합니다. 측정 된 3D 리 tomograms에서 추출 생물 매개 변수는 양적 단일 세포 수준에서 림프 구 종류의 식별 라벨 무료 사용 기계 학습 알고리즘으로 분석 됩니다. 우리는 B, T CD4 + 및 CD8 + T 림프 톨의 3D RI tomograms를 측정 하 고 80% 이상으로 그들의 세포 유형 식별 정확도. 이 프로토콜에서 우리는 림프 구 분리, 3D 양적 위상 이미징 및 림프 구 종류를 식별 하기 위한 기계 학습에 대 한 자세한 단계를 설명 합니다.

서론

림프 톨 B, 도우미 (CD4 +) T, 세포 독성 (CD8 +) T, 및 T는 규제를 포함 한 다양 한 하위 유형으로 분류 될 수 있다 세포. 각 림프 구 종류는 다른 역할 적응 면역 체계; 예를 들어 B 림프 톨 생성 항 체, T 림프 톨 특정 항을 검색 하 고 비정상 세포를 제거 하 고, B 림프 톨을 규제 하는 반면. 림프 구 기능 및 규정은 밀접 하 게 의해 제어 되며 암1,2, 자가 면역 질환 및 바이러스 감염3를 포함 하 여 다양 한 질병에 관련 된. 따라서, 림프 구 종류의 식별은 같은 질병에 immunotherapy 클리닉에 대 한 그들의 병 태 생리 역할을 이해 하는 것이 중요.

현재, 림프 구 종류를 분류 하기 위한 방법 특정 표면 막 단백질 또는 표면 마커4를 대상으로 항 원-항 체 반응에 의존 합니다. 표면 마커를 대상으로 림프 구 종류를 결정 하는 정확 하 고 정확한 방법입니다. 그러나, 그것은 비싼 시 약 및 시간이 걸리는 절차를 요구 한다. 또한, 그것은 막 단백질 구조의 수정 및 세포 기능 변경의 위험을 운반합니다.

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프로토콜

동물 관리 및 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 한국 과학 기술원 (KA2010-21, KA2014-01, 및 KA2015-03)의 승인 아래 수행 했다. 이 연구에서 모든 실험 승인된 지침에 따라 실시 했다.

1. 림프 구 별개로 마우스 피

  1. C57BL/6J 마우스는 CO2 흡입을 통해 안락사는, 일단 마우스 마음에 26 G 바늘을 삽입 하 고 0.3 mL의 혈액을 수집. 직접 넣어 혈액 튜브 100 U/mL 헤 파 린 솔루션 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 1 mL로 희석.
    참고: 또는, 비장에서 세포 수 고립.
  2. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 관을 원심
  3. 관에 염화 염화 칼륨 lysing 버퍼의 0.5 mL를 추가 하 고 부드럽게 반전 그것을 몇 번 솔루션을 혼합.
  4. 5 분 동안 실내 온도 (RT)에 튜브를 품 어.
  5. 4.5 mL PBS의 추가 하 고 두 번 4 ° C에서 5 분에 대 한 400 x g에서 centrifuging 여 세포를 씻어.
  6. 상쾌한을 제거 하 고 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 신선한 RPMI 1640 매체의 100 µ L에서 셀 펠 릿 resusp....

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결과

그림 1 전체 프로토콜의 구조 과정을 보여 줍니다. 여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 우리 B 고립 (n = 149), CD4 + T (n = 95), 및 CD8 + T (n = 112) 림프 톨. 다양 한 각도에서 조명의 위상 및 진폭 정보를 얻으려면 각 림프 톨의 여러 2D 홀로그램 (60 °-60 °)에서 조명의 각도 변경 하 여 측정 되었다. 일반적으로, 50 홀로그램 3D RI tomogram 재구성을 사용할 수 있습니다 하지만 이미징 속도 품질을 고려 하 고 2D 홀로그램의 수를 조정할 수 있습니다. 푸리에 변환43,44에 따라 필드 검색 알고리즘을 사용 하 여 측정 된 홀로그램의 진폭 및 위상 정보를 검색 합니다. 각 림프 톨의 3D RI tomogram 여러 2D 검색된 위상 및 진폭 정보.......

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토론

선물이 3D 양적 위상 이미징 및 기계 학습을 이용 하는 림프 구 종류의 레이블 없는 식별을 가능 하 게 하는 프로토콜. 이 프로토콜의 중요 한 단계는 양적 위상 이미징 및 기능을 선택 합니다. 최적의 홀로그램 영상에 대 한 위에 설명 된 대로 셀의 밀도 제어 한다. 셀의 기계적 안정성도 부동 또는 진동 세포 움직임 조명 각도 변화에 따라 홀로그램 측정을 방해 하기 때문에 정확한 3D RI 분포를 얻기 위해 중요 하다. 우리는, 따라서 샘플 된 안정적이 고 정적 이미징 챔버에 홀로그램을 측정 하기 전에 때까지 몇 분 정도 기다렸다. 홀로그램 공기와 샘플; 사이 리 차이 측정할 때 마지막으로, 이미징 챔버 내부 거품 문제가 있다 따라서, 샘플 영상 실로 신중 하 게 적재 되어야 한다.

특징 추출 및 선택 분류자의 식별 성능을 확인할. 5 양적 형태학 (CV, SA, SI) 계산 및 생화학 (PD, DM) 20 다른 RI 임계값 값; 3D 리 유통에서 기능 따라서, 우리는 총 100.......

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공개 사항

Y. 박 교수, 당 조, 텍와 S. 리 Tomocube, Inc., 광학 회절 단층 촬영 및 양적 위상 이미징 기기를 상품화 하는 작품의 스폰서 중 하나입니다 회사에에서 금융 관심 있다.

감사의 글

이 작품은 KAIST BK21 + 프로그램, Tomocube, Inc., 및 연구 재단의 국립 (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018 K 000396)에 의해 지원 되었다. Y. 조 KAIST 대통령 친목 및 아산 재단 생물 의학 과학 장학금 지원을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
마우스Daehan BiolinkC57BL/6J 마우스 성별 및 연령 일치, 6 – 8주
Falcon 원뿔형 원심분리기 튜브ThermoFisher Scientific14-959-53A15 mL
인산염 완충 식염수 Sigma-Aldrich806544-500ML
암모늄-염화물-칼륨 용해 완충액 ThermoFisher ScientificA1049201
RPMI-1640 배지Sigma-AldrichR8758
소 태아 혈청ThermoFisher Scientific10438018
항체BD Biosciences553140 (RRID:AB_394655)CD16/32 (클론 2.4G2)
항체BD Biosciences555275 (RRID:AB_395699)CD3&엡실론; (클론 17A2)
항체Biolegnd100734 (RRID:AB_2075238)CD8α (클론 53-6.7)
항체BD Biosciences557655 (RRID:AB_396770)CD19 (clone 1D3)
항체BD Biosciences557683 (RRID:AB_396793)CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
항체BD Biosciences552878 (RRID:AB_394507)NK1.1 (clone PK136)
항체eBioscience11-0041-85 (RRID:AB_464893)CD4 (clone GK1.5)
DAPI Roche102362760014,6-diamidino-2-phenylindole
유세포 분석 BD BiosciencesAria II 또는 III 
이미징 챔버Tomocube, Inc.TomoDish
홀로토모그래피Tomocube, Inc.HT-1H
홀로토모그래피 이미징 소프트웨어Tomocube, Inc.TomoStudio
이미지 전문 소프트웨어MathWorksMatlab R2017b

참고문헌

  1. Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503(2000).
  2. Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology<....

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재인쇄 및 허가

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