بروتوكول مفصل للوحة علامة ستة الفلورة متعدد هو الأمثل وتنفيذها، باستخدام الملطخ الآلي لنتائج أكثر اتساقا وأقصر وقت إجراء. هذا النهج يمكن تكييفها مباشرة بأي مختبر للدراسات المناعية-الأورام.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
لوحة الفلورة تعدد الإرسال الآلي للدراسات المناعية-علم الأورام في عينات الأنسجة الكبدية الفورمالين--ثابت
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
استمرار التطورات في علم الأورام المناعية تتطلب زيادة فهم آليات المناعة السرطان. تحليل عينات الأنسجة من الخزعات (FFPE) الفورمالين--الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين إيمونوبروفيلينج أصبح أداة أساسية لفهم تعقيدات علم المناعة الورم واكتشاف رواية المؤشرات الحيوية التنبؤية للسرطان العلاج المناعي. إيمونوبروفيلينج تحليل الأنسجة يتطلب تقييم علامات مجتمعة، بما في ذلك الفئات السكانية الفرعية الخلية الملتهبة ونقاط التفتيش، ومحصنة في ورم المكروية. ظهور أساليب الرواية المناعي متعدد يسمح لتحليل مولتيباراميتريك أكثر كفاءة لأقسام الأنسجة واحدة مما لا immunohistochemistry مونوبليكس القياسية (المدينة). واحد الفلورة متعدد المتاحة تجارياً (إذا) الأسلوب هو استناداً إلى تضخيم إشارة تيراميدي، وجنبا إلى جنب مع تحليل مجهرية متعددة الأطياف، يسمح لفصل إشارة أفضل لعلامات مختلفة في الأنسجة. هذه المنهجية متوافق مع استخدام unconjugated الأجسام الأولية التي قد تم تحسينها للمدينة الموحدة على عينات الأنسجة FFPE. هنا يصف لنا بالتفصيل بروتوكولا مؤتمتة تسمح متعدد إذا وضع العلامات لعينات الأنسجة الكبدية مع لوحة جسم متعدد علامة الستة تضم PD-L1، PD-1، CD68، CD8، وكي-67، وسيتوكيراتينس AE1/AE3 مع 4، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي كونتيرستين خلية نووية. هو الأمثل في بروتوكول الفريق متعدد في الآلي الملطخ المدينة وقت المصبوغة هو أقصر من البروتوكول اليدوي ويمكن مباشرة تطبيقها وتكييفها من قبل المحقق أي مختبر للدراسات المناعية-علم الأورام في عينات الأنسجة FFPE البشرية. ووصف أيضا هي عدة عناصر وأدوات، بما في ذلك أسلوب إسقاط--عنصر تحكم لمراقبة الجودة الجميلة للوحة إذا كان متعدد جديدة، التي تعتبر مفيدة للتحسين والتحقق من صحة هذا الأسلوب.
المقدمة
إيمونوبروفيلينج تحليل عينات الأنسجة FFPE الورم قد أصبح عنصرا أساسيا في الدراسات المناعية-الأورام، خاصة بالنسبة لاكتشاف والتحقق من صحة رواية المؤشرات الحيوية التنبؤية للسرطان العلاج المناعي في سياق التجارب السريرية1 ،2. يبقى المدينة اللونية، تشروموجينس الكيميائية مثل ديامينوبينزيديني، باستخدام تقنية قياسية في تشخيص الأمراض إيمونولابيلينج من الأنسجة خزعة3. المدينة الموحدة يمكن أن تستخدم أيضا لسرطان الأنسجة إيمونوبروفيلينج، بما في ذلك كوانتيتيشن من الفئات السكانية الفرعية من الخلايا المرتبطة بالأورام الليمفاوية، وتقييم مستويات التعبير من نقاط التفتيش المناعي مثل يجند موت الخلية المبرمج 1 ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: البروتوكول المقدمة هنا توضح كيفية إجراء إيمونوبروفيلينج فريق القوة المؤقتة المتعددة الجنسيات باستخدام حساب السياحة الفرعي لأجسام ستة (CD68، ki67، PD-L1، PD-1 و CD8 و AE1/AE3) في الآلي الملطخ (انظر الجدول للمواد). البروتوكول يصف أيضا كيفية إجراء إسقاط عناصر التحكم لمراقبة الجودة من لوحة mIF جديدة (انظر المواد التكميلية). في هذا البروتوكول، يتم تلوين مع ثماني شرائح فب أونستينيد من البشرية لوزة (مراقبة إيجابية) والشرائح أونستينيد ثمانية من غدية الرئة البشرية. وتستخدم الشريحة الأولى لكامل متعدد تلطيخ مع كافة علامات ستة، والشريحة الثانية لمراقبة ايستب التي تستخدم لا أجسام الأولية والشرائح الستة المتبقية لإسقاط عناص....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
البروتوكول هو موضح هنا سوف توفر نتائج مثل تلك المبينة في الشكل 2. البدء بتقييم لتلطيخ في عنصر التحكم لوزة، بدءاً بظهارة الخلايا الحرشفية السطحية. يمكن مراجعة علم الأنسجة للعينة لوزة مع أخصائي، استخدام الشريحة ح & ه كمرجع. إذا كانت أبواب المدينة اللونية تتم مع علامات نفس كتلة الأنسجة نفسها، ثم هذه يمكن استخدامها للتأكد من الكثافة والتوزيع لكل علامة على الشريحة القوة المؤقتة المتعددة الجنسيات. كما هو مبين في الشكل 2أ
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ثورة العلاج المناعي السرطان الجارية هو فتح الرواية وواعدة الخيارات العلاجية ل مرضى السرطان13. التقدم المحرز في مجال علم الأورام المناعية سيتطلب زيادة المعرفة بالتهاب وورم المكروية، ليس فقط لفهم بيولوجيا الآليات المناعية التي تشارك في التسرطن ولكن أيضا للبحث عن المؤشرات الحيوية التنبؤية لجديد العلاجات المستندة إلى العلاج المناعي1،2. سبب بيولوجيا المناعة السرطان معقدة، استجواب عينات الأنسجة الورم مطلوب عادة لوضع قائمة متنامية من علامات المنا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وأيد هذا العمل ميديموني، والبيولوجي العالمي R & د ذراع استرا زينيكا. C.W. والقازاقي C.C.H. هي موظفا "بيركن المر"، التي تنتج الكواشف (مجموعة حساب السياحة الفرعي) والماسحات الضوئية متعددة الأطياف التي استخدمت في هذا العمل. م. س.، ك. د، ه، W.Z.، باجنال جيم، جيم براون، كيركراده، أ. ل.، ك. س.، ومحمد، و J.R.C. من العاملين ميديموني مع امتلاك الأسهم و/أو مصالح الأسهم أو الخيارات في استرا زينيكا.
شكر وتقدير
قدم الدعم التحريري شومان ديبورا من ميديموني.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| برنامج "InForm 2.4.2" لفك الخلط الطيفي وتحليل الصور | CLS151066 يطلق على PerkinElmer | اسم "برنامج فك الخلط الطيفي" في النص | |
| "Phenochart 1.0.9" برنامج QPTIFF لاختيار MSI وعرض الشرائح الشاملة | PerkinElmer | CLS151067 | يسمى "برنامج QPTIFF" في النص |
| # 1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 دليل على الإيثانول | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| مخفف الأجسام المضادة | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 الماوس أحادي النسيلة | DAKO | M087601-2 | استنساخ PG-M1 |
| Anti-CD8 أرنب أحادي النسيلة | Ventana | M5392 | استنساخ SP239 |
| Anti-CK ماوس أحادي النسيلة | DAKO | M351501-2 | استنساخ AE1 / AE3 |
| Anti-ki67 ماوس أحادي النسيلة | DAKO | M724001-2 | استنساخ MIB-1 |
| Anti-PD-1 إشارات خلية أحادية النسيلة للأرانب | # 86163 | استنساخ D4W2J | |
| Anti-PD-L1 أرنب أحادي النسيلة | Ventana | 790-4905 | استنساخ SP263 |
| محلول إزالة الشمع السندات | Leica | AR9222 | يسمى "محلول إزالة الشمع" في النص |
| حل استرجاع حاتمة السندات 1 | Leica | AR9961 | يسمى "ER1" في النص |
| حل استرجاع حاتمة السندات 2 | Leica | AR9640 | يسمى "ER2" في |
| الحاويات المفتوحة للرابطة ، 30 مل | OP309700 Leica | تسمى "حاويات مفتوحة 30 مل" في | |
| حاويات بوند المفتوحة ، 7 مل | OP79193 Leica | تسمى "حاويات مفتوحة سعة 7 مل" في النص | |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | يسمى "مجموعة الكشف عن الكروموجينيك" في النص |
| مجموعة الكشف عن أبحاث السندات | Leica | DS9455 | تسمى "مجموعة الكشف عن البحث" في النص |
| مجموعة معايرة السندات | Leica | OPT9049 | تسمى "مجموعة المعايرة" في النص |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | يسمى "المغطى" في النص |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | يسمى "محلول غسيل 10x" في النص |
| BondRX Autostainer | Leica | يسمى "الملطخ الآلي" في النص | |
| برنامج BondRX 5.2.1.204 | Leica | يسمى "برنامج الملطخ الآلي" في النص | |
| أتمتة أوبال 7 ألوان مجموعة IHC | PerkinElmer | NEL801001KT | تسمى "مجموعة تلطيخ متعددة الأطياف" في النص |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | تسمى "حامل الشريحة" في النص |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| مجهر Vectra Polaris متعدد الأطياف مع برنامج "Vectra 3.0.5" للتحكم في المجهر متعدد الأطياف | CLS143455 PerkinElmer | يسمى "برنامج التحكم في المجهر" في النص |
المراجع
- Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
- Taube, J. M., et al. Implications....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
